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Wie kann die Expression von löslichem Protein gesteigert werden?

Updatezeit : 2021-01-05

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Wie kann die Expression von löslichem Protein gesteigert werden?
Aufgrund der einfachen Kulturbedingungen prokaryotischer Bakterien und der bequemen Einführung von Fremdgenen ist es zu einem wichtigen rekombinanten Proteinexpressionssystem geworden. Nachdem das Gen in den Stamm transformiert wurde, ist es eine herkömmliche Proteinexpressionsmethode, es zu induzieren, um das Zielprotein im Wirtsstamm zu exprimieren, es zu sammeln und zu reinigen.

Prokaryontisch exprimierte Proteine, die biologische Aktivität zeigen können, sind normalerweise lösliche Proteine, die im Überstand vorhanden sind, und unlösliche Einschlusskörper haben keine biologische Aktivität.

Daher ist die lösliche Expression des Zielproteins zum Ziel der meisten Proteinexpressionsexperimente geworden. Wie das Auftreten von Inklusionskörpern reduziert oder vermieden werden kann, ist auch ein Problem, das die meisten Menschen plagt.

expression of soluble protein

Wie kann die Expression von löslichem Protein gesteigert werden?


  • Reduzieren Sie die Geschwindigkeit der Proteinsynthese

Die Proteinsynthese ist nicht so schnell wie möglich. In vielen Fällen werden Proteine in prokaryotischen Bakterien zu schnell synthetisiert, was zu einer unzureichenden Zeit zum Falten und Bilden von Einschlusskörpern führt. In Anbetracht dessen können wir von den folgenden Aspekten ausgehen.


1. Senken Sie die Kulturtemperatur;

2. Verwenden Sie schwächere Promotoren.

3. Reduzieren Sie die Konzentration des Induktors.

4. Verwenden Sie Plasmide mit niedriger Kopie als Vektoren für fremde Gene.
Um die Proteinexpression zu erhöhen, passen viele Menschen während der Proteinexpression gewöhnlich verschiedene Bedingungen optimal an, z. B. die Aufrechterhaltung der optimalen Kulturtemperatur, die Verwendung starker Promotoren, die Erhöhung der Induktorkonzentration und die Verwendung von Plasmiden mit hoher Kopienzahl.

Diese Verfahren können zwar die Expression des Zielproteins erhöhen, aber es wird auch die Proteinexpressionsrate zu schnell machen, unfähig, Einschlusskörper vollständig zu falten und zu bilden. Wenn es zu viele Einschlussgremien gibt, kann eine angemessene Anpassung dieser Einflussfaktoren eine Lösung sein.

Sobald das Experiment fehlschlägt, braucht es viel Zeit und Energie, um die Bedingungen von Anfang an zu untersuchen. Es wird empfohlen, zu Beginn des Experiments verschiedene Bedingungen unter Verwendung verschiedener Plasmide, verschiedener Stärkepromotoren, verschiedener Kulturbedingungen und verschiedener Induktorkonzentrationen auszuprobieren. Untersuchen Sie die besten Bedingungen für die proteinlösliche Expression, um die Fehlertoleranzrate des Experiments zu verbessern.

  • Ändern Sie die Zusammensetzung des Mediums

Das Kulturmedium ist die direkte Quelle der Substanzen, die für das Wachstum von Bakterien benötigt werden. Das Anpassen der Zusammensetzung des Kulturmediums kann dazu beitragen, die Geschwindigkeit der bakteriellen Proteinsynthese zu regulieren und die Stabilität der Proteinstruktur zu verbessern. Maßnahmen umfassen:


1. Fügen Sie pH-Puffer hinzu, um den pH-Wert während der Kultur einzustellen.

2. Fügen Sie prothetische Gruppen oder Coenzymfaktoren hinzu, die dazu beitragen, dass sich Proteine richtig falten und die Proteinstabilität verbessern.

3. 1% ige Glucoselösung hinzufügen, um die durch IPTG (Isopropylthiogalactosid) verursachte induzierte Expression zu verringern;

4. Fügen Sie Saccharose und Polyol (oder Sorbit) hinzu, um den osmotischen Druck der Mittellösung zu erhöhen. Der Anstieg des osmotischen Drucks führt zur Akkumulation von intrazellulären osmoprotektiven Mitteln, was die Stabilität des Zielproteins verbessern kann.

5. Ethanol, niedermolekulare Mercaptane, Disulfidverbindungen und Natriumchlorid hinzufügen.

  • Koexpression mit molekularem Chaperon oder Faltungsenzym


Die beiden Proteine, molekulare Chaperone und Faltungsenzyme, spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Proteinexpression in Organismen. Die Coexpression von ihnen mit dem Zielprotein kann die korrekte Faltung des Proteins fördern und die Expression von löslichem Protein erhöhen, wenn das Protein exprimiert wird.

Molekulare Chaperone: Molekulare Chaperone können dazu beitragen, dass sich Proteinvorläufer richtig falten. Häufig verwendete molekulare Chaperone im E. coli-Expressionssystem umfassen:

GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE, ClpB.

Faltungsenzym: Durch die Verringerung der Energiebarriere während der Faltung hilft es dem Zielprotein, eine aktive Konformation zu bilden. Die folgenden drei Arten von Faltungsenzymen spielen eine wichtige Rolle bei der Proteinexpression.

1. PPIs (Peptidylprolyl-cis / trans-Isomerasen);

2. DsbA (Disulfidoxidoreduktase-Disulfidbindungsoxidoreduktase) und DsbC (Disulfidisomerase-Disulfidbindungsisomerase);

3. PDI (Proteindisulfidisomerase).

Das Koexpressionsniveau des Zielproteins und des molekularen Chaperons oder Faltungsenzyms hängt von der Art des spezifischen Proteins ab. Studien haben gezeigt, dass DsbA und DsbC, wenn sie mit dem Protein fusioniert sind, auch das lösliche Expressionsniveau des Proteins erhöhen können.

  • Koexpression mit Fusionsmarkierung


Das Hinzufügen von Tags zum N-Terminus und C-Terminus zur Verbesserung der löslichen Expression ist in den meisten Experimenten eine Routineoperation. Häufig verwendete Tags sind: MBP (Maltose-bindendes Protein), GST (Glutathionsulfhydryltransferase), SUMO (kleines Ubiquitin-ähnliches modifiziertes Protein), NusA, TrxA (Thioredoxin) und DsbA und DsbC, wie oben erwähnt.

Das GST-Tag (Glutathionsulfhydryltransferase) ist das am häufigsten verwendete Solubilisierungs-Tag. Es hat einen gewissen Solubilisierungseffekt, wird jedoch hauptsächlich zur Affinitätsreinigung verwendet. Das GST-Tag hat auch einen weiteren vorteilhaften Effekt auf rekombinante Proteine, nämlich den Abbau in Wirtszellen zu verringern und die Proteinstabilität zu erhöhen.

Das herausragendste Merkmal des MBP-Labels ist seine starke Fähigkeit zur Förderung der Auflösung. Studien haben gezeigt, dass der Vorteil des MBP-Tags darin besteht, dass es eine starke Rolle bei der Förderung der löslichen Expression von Membranproteinen spielt. Das MBP-Tag wurde zu 42 Membranproteinen hinzugefügt, die in E. coli unter- oder nicht exprimiert waren, von denen 29 löslich waren, insbesondere Alle niedermolekularen Proteine mit 10 bis 20 kD wurden erfolgreich exprimiert.

Das größte Merkmal von SUMO-Tags ist, dass sie durch SUMO-Protease spezifisch identifiziert und effizient abgebaut werden können, wodurch der nachfolgende Tag-Entfernungsprozess genau und effizient wird. Das SUMO-Tag wurde erfolgreich für die Fusionsexpression in Bakterien verwendet. Es kann nicht nur die Löslichkeit des rekombinanten Proteins verbessern, sondern auch seine Expression erhöhen.

NusA hat die biologische Aktivität, die DNA-Transkription zu fördern und die Translation zu verlangsamen, wodurch das exprimierte Protein mehr Zeit zum Falten hat. Es ermöglicht eine stabile und aktive Expression von rekombinanten Proteinen. Selbst wenn das NusA-Tag nicht entfernt wird, kann das Fusionsprotein immer noch aktiv sein. Daher hat NusA im Vergleich zu anderen Solubilisierungsetiketten auch einzigartige Vorteile.

Wenn Sie im Experiment auf zu viele Einschlusskörper stoßen, drückt der Überstand das Problem nicht aus.

Sie können auch die oben genannten Methoden ausprobieren. Wenn Sie es immer noch nicht lösen können, können Sie auch Generalbiosystems in Betracht ziehen, um Ihnen zu helfen. Wir sind ein professionelles Unternehmen für die Herstellung rekombinanter Proteine.