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Wie kann die Qualität der Oligonukleotidsynthese verbessert werden?

Updatezeit : 2020-12-23

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Wie kann die Qualität der Oligonukleotidsynthese verbessert werden?
Die traditionelle Oligonukleotidsynthese wird allgemein als Säulensynthese bezeichnet, die auf einem vierstufigen chemischen Phosphoramidit-Syntheseverfahren basiert, bei dem die Oligonukleotidsynthese an einer festen Phase durchgeführt wird und von den meisten kommerziellen DNA-Syntheseunternehmen immer noch verwendet wird.



Gegenwärtig kann der vollautomatische DNA-Synthesizer, der auf der Phosphoramidit-Synthesemethode basiert, den Durchsatz einer einzelnen Synthese von einer auf 1.536 Sequenzen erhöhen. Die Kosten für die Oligonukleotidsynthese nach dem Phosphoramidit-Verfahren sinken ebenfalls allmählich.

Die Säulensynthese synthetisiert normalerweise Oligonukleotide auf einer Skala von 10 bis 1000 nmol, und die Kosten pro Base liegen zwischen 0,05 und 0,17 US-Dollar. Diese Oligonukleotide können normalerweise bis zu 100 nt mit einer Fehlerrate von 0,5% oder weniger synthetisieren, und die Kopplungseffizienz jedes Monomers beträgt normalerweise bis zu 99%.

Oligonucleotide synthesis


Mit zunehmender Länge des Oligonukleotids nimmt jedoch die Ausbeute des Oligonukleotids voller Länge gewöhnlich ab. Darüber hinaus beeinflusst die zufällige Depurinierung von synthetischen Oligomeren die Ausbeute an Oligonukleotiden voller Länge, insbesondere im Säureabschützungsschritt des Synthesezyklus. Adenin ist anfällig für Depurinierung und fördert letztendlich das Rückgrat des Oligonukleotids. Fragment, wodurch die Ausbeute an Oligonukleotiden voller Länge verringert wird.



Die weitere Abnahme der Qualität der Oligonukleotidsynthese ist auf die Einführung zufälliger Mutationen während des Synthesevorgangs zurückzuführen, hauptsächlich Deletionstypen mit einer Base. Solche Fehler resultieren hauptsächlich aus der unvollständigen Entfernung der DMT-Schutzgruppe oder der geringen Gesamteffizienz der Kopplungs- und Verkappungsschritte im Synthesezyklus.

Es ist unmöglich, Synthesefehler vollständig zu beseitigen, da die Effizienz einer chemischen Reaktion nicht 100% erreichen kann. Verbesserungen im Syntheseverfahren können jedoch die Länge und Qualität der Oligonukleotidsynthese erhöhen.



Die derzeitigen Hauptlieferanten für die DNA-Synthese basieren im Allgemeinen auf säulenbasierten synthetischen Oligonukleotiden. Da das Oligonukleotid vom Säulentyp eine einzige Zusammensetzung, eine hohe Ausbeute und eine niedrige Fehlerrate aufweist, ist es für die Gensynthese einfacher zu montieren und weist eine höhere Wiedergabetreue auf, was die Schwierigkeit des Betriebs und die Kosten der Fehlerkorrektur erheblich verringert.



Der von Generalbiosystems bereitgestellte Hochdurchsatz-Oligonukleotidsynthesedienst reduziert die Schwierigkeit und die Kosten der Synthese technisch erheblich und kann kundenspezifische Anforderungen an die Oligonukleotidsynthese mit höherer Syntheseausbeute, geringer Fehlerrate und kürzerer Lieferzeit akzeptieren. .