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Drei Expressionssysteme von rekombinantem Protein

Updatezeit : 2021-02-03

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Drei Expressionssysteme von rekombinantem Protein
Die rekombinante Expression von Protein bezieht sich auf das Klonieren des Fremdgens in einen Expressionsvektor, der einen spezifischen Promotor enthält, und das Überexprimieren in E. coli unter Induktion von IPTG. Verschiedene Proteine sind für verschiedene Expressionssysteme geeignet, hauptsächlich einschließlich Expressionsvektoren, Wirtsstämmen und Induktionsbedingungen.

Wahl des Expressionsvektors:


Die Wahl des Fusionsprotein-Expressionsvektors wird durch viele Faktoren eingeschränkt. Zunächst muss auf dem Vektor eine geeignete Mehrfachklonierungsstelle vorhanden sein. Zweitens ist es notwendig, das geeignete Fusions-Tag gemäß den nachfolgenden Proteinreinigungsbedingungen auszuwählen.


Die häufig verwendeten Fusions-Tags sind His.Tag, GST.Tag, Nus.Tag und Trx.Tag. Unter diesen ist das His-Tag relativ klein und hat keinen offensichtlichen Einfluss auf die strukturellen Eigenschaften des Proteins.

Nach der Reinigung der Affinitätschromatographie ist eine Entfernung des Tags nicht erforderlich. Ein etwas größeres Tag wie GST muss jedoch im nachfolgenden Prozess mit einem bestimmten Enzym entfernt werden. In vielen praktischen Anwendungen ist es oft wünschenswert, ein lösliches aktives Protein zu exprimieren.

Die Löslichkeit eines bestimmten Zielproteins hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich des Vektors. Der Träger mit GST.Tag kann die Löslichkeit des Fusionsproteins erhöhen.


Auswahl des Wirtsstamms:


Der Expressionsstatus des gleichen Proteins in verschiedenen Wirten kann unterschiedlich sein. Die Hosts der BL21-Serie werden derzeit am häufigsten verwendet. Der von BL21 abgeleitete Rosetta-Wirtsstamm kann die Expression von eukaryotischen Proteinen mit seltenen Codons aus E. coli verstärken.

Dieser Stamm ergänzt die tRNAs der Codons AUA, AGG, AGA, CUA, CCC und GGA durch ein kompatibles Chloramphenicol-resistentes Plasmid. Auf diese Weise liefert der Rosetta-Stamm eine "universelle" Translation, wodurch Expressionsbeschränkungen aufgrund der Häufigkeit der Verwendung von E. coli-Codons vermieden werden. Der Wirt BL21 (DE3) erleichtert die Bildung von Einschlusskörpern.


Induktionsbedingungen:


Änderungen der Induktionsbedingungen beeinflussen auch die Proteinexpression. Im Allgemeinen werden lösliche Proteine meistens in praktischen Anwendungen benötigt, was das Finden der am besten geeigneten Induktionstemperatur erfordert.

Der Anteil an löslichem Protein, das von den meisten Proteinen unter Induktionsbedingungen über Nacht bei niedriger Temperatur (15 bis 25 ° C) synthetisiert wird, ist relativ groß.


Zusätzlich hat die Konzentration des Induktors auch einen Einfluss auf den Expressionszustand des Proteins, und eine niedrige Konzentration des Induktors ist vorteilhaft für die Expression des löslichen Proteins. Eine höhere Temperatur kann die Geschwindigkeit der Proteinsynthese, die Geschwindigkeit der Faltung von Zwischenprodukten zur Bildung von Aggregaten und die hydrophobe Wechselwirkungskraft erhöhen.


Das exprimierte Protein liegt wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern vor. Die höhere Induktorkonzentration (0,8-10 mM IPTG) kann auch die Bildung von Einschlusskörpern in den Bakterien fördern. Für pET-Rekombinanten mit gewöhnlichen T7-Promotoren kann IPTG mit einer Endkonzentration von 0,5 mM vollständig induziert werden, während Vektoren mit T7lac-Promotoren IPTG mit einer Endkonzentration von 0,8 mM benötigen, um vollständig induziert zu werden.


Bei einigen DE3-Wirtsbakterien kann das Ausmaß der Proteinexpression durch Einstellen der IPTG-Konzentration geändert werden. Im Allgemeinen wird eine kleine Menge an Testinduktion vor der Expression des Proteins im großen Maßstab durchgeführt, um die optimale IPTG-Konzentration und die optimale Induktionstemperatur zu bestimmen, damit das Zielprotein die beste Aktivität und Löslichkeit erreicht.

Für spezifischere Induktionsoperationen siehe Generalbiosystems - das neueste Artikel-Update des Unternehmens für die Expression rekombinanter Proteine.