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Subklonierungstechnologieprozess - Generalbiosysteme

Updatezeit : 2020-08-14

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Subklonierungstechnologieprozess - Generalbiosysteme

Die Su bcloning- Technologie bezieht sich auf das Re-Cloning von Gen-DNA-Fragmenten im Falle ihrer Gewinnung, um die Zielgen-DNA weiter zu analysieren oder zu rekombinieren. Die Subklonierungstechnologie ist auch eine molekulare Klonierungstechnologie.

Das Aufkommen dieser Technologie ermöglicht es den Menschen, Gen-DNA-Sequenzen eingehender zu untersuchen, die Funktion von Genen zu klären und den Phänotyp von Organismen aus genetischer Sicht zu analysieren.


Der technische Prozess der Subklonierung ist hauptsächlich in vier Schritte unterteilt: Erhalten des Zielfragments, Verbinden des verdauten Vektors und des Zielfragments, Übertragen in Wirtszellen sowie Identifizieren und Screening.


Verfahren zum Erhalten des Zielfragments

Erhalten Sie das Zielgenfragment direkt aus der Genbibliothek;

Verwenden Sie unter Verwendung der PCR-Technologie mRNA als Matrize, um die cDNA-Sequenz umzukehren, um die cDNA-Bibliothek zu erhalten, um das Zielgen zu erhalten.

Verwenden Sie Restriktionsenzyme, um die Donor-DNA in viele Fragmente zu schneiden und in Zellen einzuführen. Nach dem Screening werden Zellen erhalten, die das Zielgen enthalten;

Gensequenzinformationen werden erhalten und eine künstliche Synthese wird in vitro durchgeführt.


Ligation des Restriktionsverdauungsvektors und des Zielfragments

Wählen Sie die geeignete Restriktionsendonuklease, um die Zielfragmentsequenz des Vektors zu schneiden. Unter normalen Umständen gibt es drei Situationen: symmetrisches klebriges Ende, asymmetrisches klebriges Ende und stumpfes Ende. In Subklonierungsexperimenten wird eine asymmetrische Ligation am klebrigen Ende bevorzugt, die fremde DNA in den Vektor lenken kann.


Transfer in Wirtszellen

Es gibt normalerweise zwei Methoden zum Übertragen des mit dem Zielgen verbundenen Vektors in Zellen: Transformation / Transfektion und Transduktion.

Transformation / Transfektion ist der Transfer von rekombinanten Plasmiden oder Bakteriophagen in behandelte Wirtszellen; Die Transduktionsmethode besteht darin, die Wirtszellen mit Viren zu infizieren, die fremde DNA tragen. Im Allgemeinen ist die Transduktion effizienter als Transformationsmethoden.


Identifikationsscreening

Das Screening von klonierten Zellen verwendet normalerweise ein direktes Screening. Der Träger hat identifizierbare genetische Marker, die rekombinante Moleküle effektiv von ursprünglichen Zellen unterscheiden und trennen können.

Nachdem einige Trägermoleküle fremde Gene tragen, weist die Farbe der gebildeten Kolonien oder Plaques offensichtliche Änderungen auf, wie z. B. blau bis farblos, und die offensichtlichen phänotypischen Farbänderungen können rekombinante Moleküle klar unterscheiden.

Darüber hinaus gibt es einige andere Wirkstoff-Screening-Methoden, mit denen geklonte Zellen durch phänotypische Phänomene effektiv gescreent werden können.



Generalbiosystems verfügt über ein erfahrenes technisches Team und eine patentierte Gensyntheseplattform, die Kunden Subklonierungsdienste aus einer Hand bieten kann, einschließlich Zielgensynthese, Vektorkonstruktion und -transformation, Identifizierung und Screening.

Im Subklonierungsdienst werden 4 μg Trockenpulverplasmid-DNA, Glycerinbakterien oder Punktionsbakterien, die Plasmide enthalten, Sequenzierungsergebnisse (Format ab1) und Dokumente zur Überprüfung der Enzymverdauung, die die QC-Prüfung bestanden haben, geliefert. Generalbiosystems bietet Kunden genaue und schnelle Subklonierungsdienste.