Strategien für eine hocheffiziente E. coli-Proteinexpression

(1) Die Wahl des Expressionsvektors.

Die Wahl des Expressionsvektorpromotors ist sehr wichtig. Die Struktur des Promotors beeinflusst seine Affinität zur RNA-Polymerase und damit das Ausmaß der Genexpression. Der ideale Promotor sollte befriedigen:

(2) Codonoptimierung.

Wenn Gene, die eine große Anzahl seltener Codons enthalten, in E. coli exprimiert werden, verringert das Fehlen bestimmter tRNAs in E. coli die Effizienz und Stabilität der mRNA-Translation und verursacht sogar Translationsfehler oder vorzeitige Beendigung. Eine Codonmodifikation des Zielgens kann die Stabilität und Translationseffizienz von mRNA verbessern.

(3) Fusionsproteine und molekulare Chaperone.

Fusionsproteine können nicht nur als Affinitätsmarkierungen verwendet werden, um nachgeschaltete Reinigungsvorgänge zu erleichtern, sondern auch makromolekulare Fusionsproteine können die lösliche Expression von Proteinen wie Glutathion-S-Transferase (GST), SUMO-Protein, Maltose-Bindungsprotein (MBP) erhöhen ist stark hydrophil, trägt zur Verbesserung der Löslichkeit und Stabilität des Zielproteins bei; Die Koexpression molekularer Chaperone kann die posttranslationale Faltung und Verarbeitung rekombinanter Proteine fördern und die Löslichkeit und Stabilität des Proteins verbessern.

Im E. coli-System werden üblicherweise GroEL- und GroES-Systeme verwendet; Hitzeschockprotein DnaK, DnaJ und GrpE ternäres System; Dsb-Familie (Disulfidbindungsreduktase und Isomerase), die die Bildung von Disulfidbindungen fördern kann.

(4) Die Lokalisierung und Expression des Zielproteins.

Nachdem das rekombinante Protein in E. coli synthetisiert wurde, gibt es 4 Lokalisationen, nämlich im Zytoplasma, im periplasmatischen Raum, in der inneren oder äußeren Membran und in der extrazellulären Matrix.

Verwenden Sie Signalpeptide, um rekombinante Proteine in das Periplasma oder das extrazelluläre Medium abzuscheiden. Die oxidative Umgebung im periplasmatischen Raum fördert die Bildung von Disulfidbindungen und die korrekte Faltung von Proteinen auf Thiobasis. Die Protease im periplasmatischen Raum ist niedriger als die in der Zelle Many, um den Abbau des Zielproteins zu verringern. Die Anzahl der Proteine im periplasmatischen Raum ist ebenfalls viel geringer als die in der Zelle, was der Reinigung des Zielproteins förderlich ist.

(5) Auswahl von Expressionsstämmen.

Zu viele endogene Proteasen im Stamm können die Instabilität exogener Expressionsprodukte verursachen. Daher werden einige Stämme mit Protease-Mangel häufig zu idealen Stämmen für die anfängliche Expression.

Die Rosetta2-Reihe ergänzt die tRNAs (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA und CGG), die sieben seltenen Codons entsprechen, denen E. coli fehlt, und verbessert das Expressionsniveau von Fremdgenen, insbesondere eukaryotischen Genen, im prokaryotischen System. Von K-12 abgeleitete Stämme der Origami 2-Serie, trxB- und gor-Doppelmutantenstämme, erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Disulfidbindungen im Zytoplasma signifikant und fördern die Expression löslicher Proteine. Rosetta-gami ™ kombiniert die Vorteile der beiden oben genannten Arten von Stämmen.

Es ergänzt nicht nur 7 Arten seltener Codons, sondern fördert auch die Bildung von Disulfidbindungen und hilft bei der Expression von eukaryotischen Proteinen, die die Hilfe von Disulfidbindungen benötigen, um eine korrekte gefaltete Konformation zu bilden.

(6) Induktionsbedingungen und Kulturbedingungen

Induktionsbedingungen und Kulturbedingungen sind auch entscheidend für die Expression rekombinanter Proteine, wie z. B. die Temperatur. Wenn die Temperatur höher ist, ist die Proteinexpression hoch, aber es ist leicht, Einschlusskörper zu bilden, während bei niedriger Temperatur die Proteinexpression niedrig ist, aber die Löslichkeit des Zielproteins erhöhen kann; Die Konzentration des Induktors beeinflusst auch die Expressionseffizienz des rekombinanten Proteins, beispielsweise kann eine IPTG-Induktion mit niedriger Konzentration den Gehalt an löslichem Protein erhöhen.

Zusätzlich können die Nährstoffzusammensetzung, der pH-Wert und andere Parameter des Mediums die Aktivität, Sekretion und das Expressionsniveau der Protease beeinflussen.