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Verschiedene Formen der Proteinexpression in E. coli

Updatezeit : 2020-10-19

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Verschiedene Formen der Proteinexpression in E. coli

Es ist ein wichtiger Teil der molekularbiologischen Forschung, die Struktur und Funktion des Fremdgens im Proteinexpressionssystem in vitro zu untersuchen. Die Proteinexpression in vitro umfasst die Fusionsexpression und die Nichtfusionsexpression sowie die Expression in Säuger-Expressionssystemen, Hefe-Expressionssystemen und Insektenzell-Expressionssystemen. Escherichia coli hat die Eigenschaften eines gründlichen Verständnisses der Erbmerkmale, des schnellen Wachstums, der Wirtschaftskultur und des hohen Expressionsniveaus.

Daher war die E. coli-Expression lange Zeit das bevorzugte Expressionssystem für die Expression von Fremdproteinen.



Das Escherichia coli-Expressionssystem ist das bevorzugte technische Bakterium für die Proteinexpression und es ist auch das am weitesten verbreitete klassische prokaryotische Expressionssystem.

Forscher von General Biosystems haben eine ausgereifte Plattform für die Expression und Reinigung von E. coli-Proteinen eingerichtet , die Expressions- und Reinigungsdienste einschließlich verschiedener rekombinanter Proteine und ihrer Komplexe in E. coli bereitstellt.

Escherichia coli ist durch die äußere und innere Membran in drei Hohlräume unterteilt. Das von E. coli exprimierte Zielprotein befindet sich in den drei Hohlräumen: intrazellulär, extrazellulär und Periplasma.
Entsprechend dem Ort des Expressionsprodukts wird die Expression des Zielgens in E. coli im Allgemeinen in intrazelluläre Expression und sekretorische Expression unterteilt.
Unter diesen ist die intrazelluläre Expression die wichtigste Expressionsform, und ihre Expressionsprodukte können in lösliche Expressions- und unlösliche Einschlusskörperformen unterteilt werden. Entsprechend der Art des Zielproteins wird die Expressionsform des Zielproteins in E. coli in Fusions- und Nichtfusions-Expression unterteilt.

1. Intrazelluläre Expression


Das von E. coli exprimierte Zielprotein ist häufig in der Zelle lokalisiert. Um eine übermäßige Anreicherung des Expressionsprodukts in der Zelle zu vermeiden und das Zellwachstum zu beeinflussen oder Einschlusskörper zu bilden, kann das lösliche Zielprotein seine eigene funktionelle Sequenz und das Verarbeitungs- und Transportsystem des E. coli-Proteins verwenden, um schließlich die Zellmembran zu durchqueren und sezernieren in den periplasmatischen Raum zwischen der Zellmembran und der Zellwand oder der Zellkulturflüssigkeit.

2. Sekretierter Ausdruck


Das rekombinante Zielprotein kreuzt die innere Membran von E. coli, um den periplasmatischen Raum zu erreichen, oder kreuzt die äußere Membran, um den extrazellulären Raum zu erreichen, der als Sekretion bezeichnet wird. Es wurde eine Reihe von Sec-Proteinsequenzstrukturen gefunden, die mit der Sekretion von E. coli-Proteinen in den periplasmatischen Raum und dem Transmembrantransport außerhalb der Zelle zusammenhängen, einschließlich SecA, SecB, SecD, SecE, SecF, SecG und SecY [9, diese 7]. . Neben dem Sec-Protein sind auch molekulare Chaperone wie GroES / GroEL, DnaK / DnaJ und h / Ffs am Transport beteiligt.

3. Löslicher Ausdruck


Die Expression des Zielgens in Escherichia coli ist normalerweise in der Lage, eine lösliche Expression mit biologischer Aktivität zu erhalten. Fremdproteine werden jedoch häufig leicht durch Wirtsproteasen abgebaut oder bilden Einschlusskörper, während hohe Expressionsniveaus erhalten werden.

Daher ist es notwendig, die lösliche Expression von Fremdproteinen in E. coli zu untersuchen. Um die lösliche Expression von rekombinantem Protein zu verbessern, ist es erstens notwendig, einen geeigneten Vektor und Wirtsbakterien auszuwählen, und zweitens kann es auch die Geschwindigkeit der rekombinanten Proteinsynthese verringern.


Studien an Proteinkinetikmodellen zeigen, dass die Ausbeute an aktivem Protein von der Geschwindigkeit der Proteinsynthese, der Geschwindigkeit der Proteinfaltung und der Geschwindigkeit der Proteinaggregation abhängt.

Bei hohen Expressionsniveaus führt die Aggregationsrate der entstehenden Peptidkette, sobald sie die Geschwindigkeit der Proteinfaltung überschreitet, zur Bildung von Einschlusskörpern.

Daher ist eine Verringerung der Geschwindigkeit der rekombinanten Proteinsynthese vorteilhaft, um die lösliche Expression des rekombinanten Proteins zu erhöhen.

Üblicherweise verwendete Verfahren umfassen das Verringern der Kulturtemperatur, das Auswählen eines geeigneten Promotors und das Verwenden einer niedrigeren Induktorkonzentration.



Die Zusammensetzung des Mediums hat einen signifikanten Effekt auf die Verbesserung der löslichen Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli.

Molekulares Chaperon ist eine Art Protein, das der Polypeptidkette helfen kann, die richtige dreidimensionale Struktur zu bilden.

Es hilft hauptsächlich bei der Faltung der Peptidkette, indem es eine unzumutbare hydrophobe Bindung verhindert oder korrigiert. Studien haben gezeigt, dass die Koexpression mit molekularen Chaperonen die Löslichkeit des Zielproteins verbessern kann. Wenn mehrere molekulare Chaperone gleichzeitig exprimiert werden, können bessere Ergebnisse erzielt werden, als wenn sie allein verwendet werden.

Es ist erwähnenswert, dass die Wahl der koexprimierenden molekularen Chaperone auf den Eigenschaften des rekombinanten Proteins selbst beruhen sollte.

Die Primärstruktur des Proteins, nämlich die Aminosäuresequenz, ist ein wichtiger Faktor, der die Bildung von Einschlusskörpern beeinflusst. Das Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren im Protein kann die Bildung von Einschlusskörpern hemmen und die Löslichkeit des exprimierten Produkts erhöhen.

Der mögliche Grund ist, dass sich die Hydrophobizität des rekombinanten Proteins ändert oder die Stabilität des rekombinanten Proteins nach der Mutation zunimmt.


4. Form Einschlusskörper Ausdruck


Wenn das Zielprotein jedoch in großen Mengen exprimiert wird, reichert sich das Expressionsprodukt in E. coli an und es bilden sich inaktive feste Partikel, sogenannte Einschlusskörper.

Das Zielprotein des Einschlusskörpers hat die richtige Aminosäuresequenz, aber da es nicht richtig gefaltet ist und einen räumlichen Konformationsfehler aufweist, ist es im Allgemeinen nicht biologisch aktiv.

Im Vergleich zu löslichen Zielproteinprodukten haben Einschlusskörper die Vorteile einer Anreicherung des Zielproteins, einer Resistenz gegen Proteasen und einer geringeren Toxizität für den Wirt.

Der Hauptgrund für die Bildung von Einschlusskörpern ist das Fehlen einiger Cofaktoren für die Proteinfaltung während der Expression des rekombinanten Zielproteins, oder die Umgebung ist nicht zur Bildung korrekter Sekundärbindungen geeignet.

Die Hauptfaktoren, die die Bildung von Einschlusskörpern beeinflussen, sind die Natur des Proteins selbst, die Kulturbedingungen und die molekularen Chaperonproteine.


5. Fusionsproteinexpression


Die Fusionsproteinexpression besteht darin, die codierenden Regionen von zwei oder mehr Genen Ende an Ende zu verbinden und dann durch dieselbe regulatorische Sequenz zu steuern, so dass die Zielprotein-Fusionsexpression eine hohe Effizienz, weniger Abbau und eine einfache und bequeme Reinigung aufweist.

Zusätzlich kann die im Fusionsexpressionsvektor konstruierte chemische Reagenzspaltungsstelle oder Protease-Spaltstelle verwendet werden, um das prokaryotische Peptid des Fusionsproteins in vitro zu entfernen, um ein natürliches Proteinprodukt zu erhalten.

Da das Fusionsprotein leicht herzustellen ist, hat es eine höhere Wahrscheinlichkeit, die Aktivität und Immunogenität des ursprünglichen Proteins aufrechtzuerhalten, und es kann auch kommerzialisiert werden, um die Möglichkeit für eine nachfolgende Spaltung des Fusionsproteins bereitzustellen, um das eukaryotische Protein im Inneren zu erhalten.

Darüber hinaus kann die Fusionsexpression nicht nur die Menge der Proteinexpression erhöhen, sondern auch dazu beitragen, dass sich das Zielprotein korrekt faltet, um lösliches Protein zu erhalten.


Gegenwärtig umfassen die am weitesten verbreiteten Fusions-Expressionssysteme PA-System, PG-System, His-Fusionssystem, GST-System, FLAG-System, MBP-System, TrxA-Fusionssystem usw.

Das in der prokaryotischen Expression exprimierte Expressionsprodukt ist hocheffizient, relativ stabil und wird vom Wirt nicht leicht abgebaut.


6. Nicht-Fusionsproteinexpression


Die Nicht-Fusions-Expression eines exprimierten Proteins, das mit keinem Protein oder Polypeptid der Wirtszelle fusioniert ist, besteht darin, das Zielgen in den starken Promotor des Expressionsvektors und stromabwärts der SD-Sequenz mit dem Initiationscodon AUG des Zielgen als Ausgangspunkt der Translation.

Der N-Terminus der exprimierten Zielprotein-Peptidkette enthält nicht das vom prokaryotischen Expressionsvektor exprimierte Protein, und das exprimierte Zielprotein stimmt in Sequenz, Struktur und Immunogen mit dem natürlichen Protein überein.

Nicht-Fusionsproteine werden leicht durch Proteasen in Wirtszellen abgebaut oder zerstört, um inaktive Proteine zu produzieren, was die Expressionseffizienz beeinflusst.


Die Expression von Fremdproteinen in Escherichia coli hat die Vorteile eines hohen Expressionsniveaus, einer einfachen Operation und geringer Kosten.

Übliche Expressionsformen umfassen intrazelluläre Expression, sekretierte Expression, lösliche Expression, unlösliche Einschlusskörperform sowie Fusionsexpression und Nichtfusionsexpression.

Mehrere Formen. Die Expression von Fremdproteinen in E. coli ist ein systematisches Projekt. Daher sollten wir Erfahrungen im Forschungsprozess sammeln, um den Schlüssel zur Verbesserung der Effizienz der rekombinanten Proteinexpression herauszufinden.

Daher ist es möglich, das E. coli-Expressionssystem zu verwenden, um große Mengen an aktiven Fremdproteinen zu exprimieren.


General Biosystems , ein Dienstleistungsunternehmen für Proteinexpression und -reinigung, kann Kunden häufigere Wirtsdienste anbieten, darunter E. coli, Hefe- und Säugetierzellen. Wenn Sie andere Wirtszellen oder zellfreie Expressionssysteme verwenden möchten, kontaktieren Sie uns bitte.