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Mehrere wirksame Strategien zur Proteinexpression

Updatezeit : 2020-10-28

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Mehrere wirksame Strategien zur Proteinexpression
Das Forum ist jeden Tag durchnässt und das Experiment wird jeden Tag durchgeführt, aber das Protein wird immer noch nicht gut exprimiert?

Der Herausgeber stellt hiermit mehrere effektive Strategien vor, die sehr effektiv sind, um funktionelles rekombinantes Protein mit hoher Ausbeute zu erhalten!

Das Säuger-Expressionssystem überwindet das Problem der posttranslationalen Modifikation der Proteinexpression im prokaryotischen Expressionssystem.

Das exprimierte Protein hat die Funktionen der Faltung und Modifikation, ist stark humanisiert und kann für Struktur- und Funktionsanalysen verwendet werden.

Es gibt normalerweise zwei Möglichkeiten, Proteine in Säugetierzellen zu exprimieren: vorübergehende Expression und stabile Transfektion (Aufbau stabiler Zelllinien).


Die Verwendung einer stabilen Zelltransfektion zur Transfektion von Fremdgenen in Zellchromosomen kann das Zielprotein für eine lange Zeit stabil produzieren. Die Versuchskosten sind jedoch hoch, der Zyklus ist lang und die Operation ist schwierig.

Transiente Proteinexpression bedeutet, dass das Fremdgen auf dem freien Vektor vorhanden ist und nicht in die Chromosomen der Zelle transfiziert wurde.

Nachdem das Plasmid konstruiert wurde, kann das Zielprotein durch die Schritte der Zellwiederherstellung, Transfektion, Zellkultur und Proteinreinigung erhalten werden.

Die Bedienung ist einfach, die Versuchskosten sind gering und der Zyklus ist kurz. Es ist am besten für die schnelle und kleine Herstellung einer bestimmten Menge an rekombinantem Protein und rekombinantem Antikörper geeignet.


Kommen Sie und sehen Sie, wie Sie die vorübergehende Proteinexpression verbessern können!

Strategie 1: Optimieren Sie die Codierungssequenz

Entwerfen Sie gemäß der spezifischen nachgeschalteten Anwendung die beste Codierungssequenz und wählen Sie den am besten geeigneten Expressionsvektor aus. Vor dem Start der Proteinexpression können durch die Verwendung von Codonoptimierungsalgorithmen (wie OptimumGene ™ oder GenSmart Codon Optimization) und einer Anleitung zur Auswahl von Expressionsvektoren Zeit, Aufwand und Kosten gespart werden.
Wissen Sie? GeneralBiosystems kann integrierte Dienste von der Gensynthese (freie Codonoptimierung) bis zur Proteinexpression und -reinigung bereitstellen!

Strategie 2: Verbesserung der Proteinlöslichkeit

Eine geringe Proteinlöslichkeit ist ein Schlüsselfaktor, der eine geringe Ausbeute an rekombinanter Proteinexpression verursacht. Wir empfehlen, einige häufig verwendete Expressionsbedingungsparameter anzupassen, um die Löslichkeit des Proteins zu verbessern.

Temperatur:

Für HEK293 und andere Säugetierzelllinien wird empfohlen, Zellen in einem Inkubator mit 37 ° C und 5% CO2 zu kultivieren. Einige Studien haben gezeigt, dass eine Inkubation der Temperatur von 37 ° C auf 33 ° C 24 Stunden nach der Transfektion die Proteinexpression von HEK293-Zellen erhöhen kann.

Obwohl die von verschiedenen Lieferanten bereitgestellten Basalmedien sehr ähnlich sind, können geringfügige Unterschiede zwischen ihnen das Wachstum spezifischer exprimierender Zelllinien beeinflussen.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Konzentration, den pH-Wert, den Typ und sogar die Charge oder Chargenanzahl externer Komponenten, wie z. B. dem Kulturmedium zugesetztes Serum, optimieren.


Mittlere Zusatzstoffe:

In einigen Fällen empfehlen wir, dem Medium spezifische Reagenzien zuzusetzen, um die Proteinexpression zu erhöhen. Zum Beispiel kann die Zugabe von Histon-Deacetylase-Inhibitoren Chromatin depolymerisieren und die Transkriptionsaktivität integrierter Gene erhöhen. Alternativ kann das Hinzufügen spezifischer Wachstumsfaktoren zum Medium dazu beitragen, die Proteinproduktion zu erhöhen.

Strategie 3: Verwenden Sie einen Fusionspartner

Protein-Tags sind kurze Peptidsequenzen, die in rekombinante Proteine eingefügt werden und zur Erhöhung der Proteinexpression verwendet werden können. Es wird normalerweise durch Enzymverdauung oder chemische Reagenzien am Ende der Proteinexpression entfernt.

Die Wahl der richtigen Bezeichnung für ein bestimmtes Expressionssystem hängt von vielen Faktoren ab. Wenn das Ziel darin besteht, extrem hohe Ausbeuten zu erzielen, müssen Sie solubilisierende Tags verwenden.

Beispielsweise hat GST ein starkes Translationsinitiationssignal und kann die Expression auf hoher Ebene fördern. Wenn jedoch eine niedrigere Expressionsstufe erforderlich ist, wird empfohlen, strengere Epitop-Tags wie His-Tags zu verwenden.


Strategie 4: Optimieren Sie die Reinigungsmethode

Entwerfen Sie verschiedene Reinigungsmethoden entsprechend den nachgeschalteten Anwendungen und Reinheitsanforderungen.

Wenn das Proteinexpressionsniveau hoch ist, kann das einstufige Affinitätsreinigungsverfahren verwendet werden, um eine ausreichende Menge und Reinheit des Proteins zu erhalten, um verschiedene nachgeschaltete Anwendungen zu erfüllen.

Wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, kann die Größenausschlusschromatographie (SEC) normalerweise nach der Affinitätsreinigung durchgeführt werden. Zur weiteren Reinigung kann Ionenaustauschchromatographie (Ionenaustausch, IEX) verwendet werden.