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Tags zur Reinigung der Proteinexpression

Updatezeit : 2020-11-10

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Tags zur Reinigung der Proteinexpression
Einige Peptide und Proteine werden häufig bei der Massenproduktion von rekombinanten Proteinen verwendet. Sie werden mit dem Zielprotein fusioniert und exprimiert, um die Expression, den Nachweis, die Verfolgung und die Reinigung des Zielproteins zu erleichtern. Solche Peptide oder Proteine werden Protein-Tags genannt. Generalbiosystems kann je nach Kundenbedürfnissen eine Vielzahl von Proteinexpressions-Tags verwenden, einschließlich His, Sumo, GST, MBP usw., um maßgeschneiderte Proteinexpressions- und Reinigungsdienste bereitzustellen.

6 * Sein Tag:


6 * His bezieht sich auf eine Fusionsmarkierung, die aus sechs Histidinresten besteht, die am C-Terminus oder N-Terminus des Zielproteins inseriert werden können.

Als Tag soll man ein Epitop bilden, um die Reinigung und den Nachweis zu erleichtern; Das andere besteht darin, ein einzigartiges Strukturmerkmal (Bindungsligand) zu bilden, um die Reinigung zu erleichtern.

Die Seitenkette von Histidinresten hat eine starke Anziehungskraft auf festes Nickel und kann für die immobilisierte Metallchelat-Chromatographie (IMAC) verwendet werden, um rekombinante Proteine abzutrennen und zu reinigen.


Die Verwendung von His-Tag weist die folgenden Eigenschaften auf:


1. Das Molekulargewicht des Tags ist klein, nur ~ 0,84 kD, was im Allgemeinen die Funktion des Zielproteins nicht beeinflusst;

2. Sein Tag-Fusionsprotein kann in Gegenwart nichtionischer Tenside oder unter denaturierenden Bedingungen gereinigt werden. Ersteres wird zur Reinigung von stark hydrophoben Proteinen verwendet, und letzteres ist besonders nützlich bei der Reinigung von Einschlusskörperproteinen.

Nachdem das Denaturierungsmittel gelöst ist, wird das Verunreinigungsprotein durch Metallchelat-Affinitätschromatographie entfernt, so dass die Renaturierung nicht durch andere Proteine gestört wird, oder die Metallchelat-Affinitätschromatographie wird renaturiert;


3. Sein Tag-Fusionsprotein wird auch zur Untersuchung von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen verwendet.

4. Sein Tag weist eine relativ geringe Immunogenität auf, und das gereinigte Protein kann Tieren direkt zur Immunpräparation von Antikörpern injiziert werden.

5. Es kann auf eine Vielzahl von Expressionssystemen unter milden Reinigungsbedingungen angewendet werden;

6. Es kann mit anderen Affinitäts-Tags verwendet werden, um elterliche Affinitäts-Tags zu erstellen.

GST-Tag:


Das GST-Tag-Protein (Glutathionsulfhydryltransferase) selbst ist eine Transferase, die eine wichtige Rolle im Entgiftungsprozess spielt, und ihre natürliche Größe beträgt 26 kD. Es wird hauptsächlich in der prokaryotischen Expression verwendet.

Es gibt ungefähr zwei Gründe für seine Anwendung in der prokaryotischen Expression.

Zum einen handelt es sich um ein hochlösliches Protein, und es besteht die Hoffnung, dass es zur Erhöhung der Löslichkeit von Fremdproteinen verwendet werden kann. Das andere ist, dass es im Dickdarm verwendet werden kann. Eine große Menge an Expression im Bazillus spielt eine Rolle bei der Erhöhung der Menge an Expression.


Das GST-Fusions-Expressionssystem wird häufig bei der Expression verschiedener Fusionsproteine verwendet und kann in Wirtszellen wie E. coli und Hefe exprimiert werden.

Das gebundene Fusionsprotein wurde mit 10 mM reduziertem Glutathion unter nicht denaturierenden Bedingungen eluiert. In den meisten Fällen ist das Fusionsprotein in wässriger Lösung löslich und bildet ein Dimer.


GST-Tags können leicht durch enzymatische Analyse oder Immunoassay nachgewiesen werden. Tags schützen rekombinante Proteine vor dem Abbau durch extrazelluläre Proteasen und verbessern deren Stabilität. In den meisten Fällen ist das GST-Fusionsprotein vollständig oder teilweise löslich.

Reinigung: Das vom Expressionssystem exprimierte GST-markierte Protein kann direkt aus dem Bakterienlysat unter Verwendung eines Affinitätsharzes gereinigt werden, das reduziertes Glutathion (Glutathionesepharose) enthält.

GST-markierte Proteine können unter milden, nicht denaturierenden Bedingungen eluiert werden, so dass die Antigenität und die biologische Aktivität des Proteins erhalten bleiben.

GST verliert unter denaturierenden Bedingungen seine Fähigkeit, an Glutathionharz zu binden, so dass dem Reinigungspuffer keine starken Denaturierungsmittel wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff zugesetzt werden können.


Wenn Sie den GST-Fusionsteil entfernen möchten, können Sie eine ortsspezifische Protease-Exzision verwenden.

Nachweis: Zum Nachweis kann ein GST-Antikörper oder ein exprimierter Zielprotein-spezifischer Antikörper verwendet werden.

SUMO Tag:


Das SUMO-Tag-Protein ist ein niedermolekularer Ubiquitin-ähnlicher Modifikator (Smallubiquitin-Likemodifikator) und eines der wichtigen Mitglieder der Ubiquitin-Polypeptidketten-Superfamilie.

In der Primärstruktur weisen SUMO und Ubiquitin nur eine Homologie von 18% auf, aber die Tertiärstruktur und die biologischen Funktionen der beiden sind sehr ähnlich.

Studien haben gezeigt, dass SUMO als Fusionsmarkierung und molekulares Chaperon für die rekombinante Proteinexpression verwendet werden kann.

Es kann nicht nur die Expression des Fusionsproteins weiter erhöhen, sondern hat auch die Funktion, der Proteasehydrolyse zu widerstehen, die korrekte Faltung des Zielproteins zu fördern und die Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu verbessern.


Darüber hinaus hat SUMO eine wichtige Anwendung, dh es kann verwendet werden, um das Tag-Protein vollständig zu entfernen, um natürliches Protein zu erhalten.

Weil das proteolytische SUMO-Enzym die vollständige SUMO-Tag-Proteinsequenz erkennen und SUMO effizient aus dem Fusionsprotein herausschneiden kann.

Nach dem Entfernen des SUMO wird nach der Affinitätschromatographie der Tag-Protein-Teil entfernt und das rekombinante Protein ist das gleiche wie das natürliche Protein.

Daher wird das SUMO-Tag auch häufig in Verbindung mit anderen Tags als spezifische enzymatische Verdauungsstelle verwendet.


MBP-Tag:


Das MBP-Tag-Protein (Maltose Binding Protein) hat eine Größe von 40 kDa und wird vom malE-Gen von E. coli K12 codiert. MBP kann die Löslichkeit von in Bakterien, insbesondere eukaryotischen Proteinen, überexprimierten Fusionsproteinen erhöhen. Die MBP-Markierung kann leicht durch Immunoassay nachgewiesen werden. Es ist notwendig, das Tag mit einer ortsspezifischen Protease zu spalten. Wenn das Protein in Bakterien exprimiert wird, kann MBP an den N-Terminus oder C-Terminus des Proteins fusioniert werden.

Reinigung: Das Fusionsprotein kann durch vernetzte Stärkeaffinitätsschicht weiter gereinigt werden. Das gebundene Fusionsprotein kann mit 10 mM Maltose in physiologischem Puffer eluiert werden. Die Bindungsaffinität liegt im mikromolaren Bereich. Einige Fusionsproteine können in Gegenwart von 0,2% Triton X-100 oder 0,25% Tween 20 nicht effektiv binden, während andere Fusionsproteine nicht betroffen sind. Die Pufferbedingung ist pH 7,0 bis 8,5 und die Salzkonzentration kann bis zu 1 M betragen, Denaturierungsmittel können jedoch nicht verwendet werden. Wenn Sie den MBP-Fusionsteil entfernen möchten, können Sie eine ortsspezifische Protease-Exzision verwenden.

Nachweis: Zum Nachweis kann ein MBP-Antikörper oder ein exprimierter Zielprotein-spezifischer Antikörper verwendet werden.