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Proteinexpressions- und Reinigungsprotokoll

Updatezeit : 2020-10-15

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Proteinexpressions- und Reinigungsprotokoll

Die Untersuchung von Proteinfunktionen und die Produktion von funktionellen Proteinen sind grundsätzlich untrennbar mit der heterologen Expression und Reinigung von Proteinen verbunden.

Heute werde ich mit Ihnen über die Proteinexpression und -reinigung unter folgenden Gesichtspunkten sprechen.


1. Etikettenauswahl


Derzeit übliche Expressions-Tags sind His-Tag (Histidin-Tag), GST-Tag (Glutathion-Sulfhydryl-Transferase-Tag), MBP-Tag (Maltose-Bindungsprotein-Tag), CBD-Tag (Chitin-Bindungsregion-Tag).

Jedes Tag hat einzigartige Eigenschaften, wie das Molekulargewicht des Tags, seine Fähigkeit, die Proteinlöslichkeit zu regulieren, seine Wirkung auf die Proteinfaltung, ob es herausgeschnitten werden muss usw.

Wählen Sie ein geeignetes Etikett entsprechend den Eigenschaften des Proteins, das Sie reinigen möchten. Das Etikett ist gut ausgewählt, und nachfolgende Experimente erzielen mit halbem Aufwand das doppelte Ergebnis.

2. Vektorkonstruktion


Nach Auswahl der zu verwendenden Markierung muss ein Expressionsvektor erstellt werden. Gegenwärtig stehen viele kommerzialisierte Vektoren zur Auswahl, wie die pET28-Serie mit His-Tag und die pMAL-Serie mit MBP-Tag.

Die meisten Vektorserien umfassen die Form des Einfügens des Tags in den N-Terminus oder C-Terminus, der entsprechend den Eigenschaften des Proteins flexibel ausgewählt werden kann.

Beim Einfügen des Protein-kodierenden Gens müssen Sie darauf achten, dass keine Bildverschiebung auftritt. Wenn Sie einen Vektor von Grund auf neu konstruieren möchten, vergessen Sie nicht, einen geeigneten Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz einzufügen. Promotorsequenzen verwenden im Allgemeinen induzierbare Promotoren, konstitutive Promotoren verursachen eine vorzeitige Expression und Akkumulation von Fremdproteinen, was der Proliferation des Wirts nicht förderlich ist.


3. Hostauswahl


Gemeinsame Wirte sind E. coli, Säugetierzellen, Hefe und Insekten. Für E. coli ist BL21 und seine Derivatstämme der am besten geeignete Stamm für die heterologe Expression, er muss jedoch noch gemäß den im Vektor ausgewählten Transkriptions- und Translationselementen ausgewählt werden.


Das endogene Protease-Gen in BL21 fehlt, so dass es ein Stamm ist, der für die Expression von Fremdproteinen geeignet ist, aber keine T7-RNA-Polymerase aufweist, so dass es nicht für die Proteinexpression verwendet werden kann, die T7-Promotor enthält; BL21 (DE3) in BL21 Basierend auf der Integration des T7-Phagengenoms ist es für T7-Expressionssysteme wie die pET-Reihe geeignet; BL21 (DE3) PLySs, basierend auf BL21 (DE3), mit dem T7-Lysozym-Gen, das die Expression von T7-Polymerase strenger steuern kann.


Es sollte beachtet werden, dass aufgrund der Existenz von Genen wie Endonuklease (endA1) -Rekombinase (recA1) das Plasmid in der BL21-Stammreihe nicht so stabil ist und in das Genom, den Verlust, die Mutation usw. integriert werden kann. Konstruieren Sie also einen guten Vektor. Er muss noch in Stämmen wie DH5α gespeichert werden.


4. Optimierung der Kulturbedingungen


Am Beispiel des E. coli-Expressionssystems kann das LB-Medium sowohl zur Wiederbelebung als auch zur Samenkultur verwendet werden.

Es ist besser, ein Medium mit höherem Aminosäuregehalt, aber geringerer Zuckerquelle während der Fermentationsphase zu verwenden, wie z. B. TB-Medium, um die Proteinsynthese und -akkumulation zu fördern.

Wenn ein induzierbarer Promotor verwendet wird, sollte ein Induktor wie IPTG hinzugefügt werden, wenn die Bakterien bis zur späten logarithmischen Wachstumsphase wachsen.

Nach Zugabe des Induktors muss die Kulturtemperatur auf 16-30 ° C gesenkt werden. Je niedriger die Kulturtemperatur ist, desto langsamer ist die Akkumulation von Protein und desto weniger wahrscheinlich ist es, Einschlusskörper zu produzieren.


5. Auswahl des Materials der Reinigungssäule

Jedes Etikett hat ein entsprechendes Reinigungssäulenmaterial. Das GST-Tag verwendet Glutathiongel, das MBP-Tag verwendet Polysaccharidharz, das CBD-Tag verwendet Chitinharz und das His-Tag verwendet Füllstoffe, die mit zweiwertigen Metallionen gekoppelt sind, von denen das häufigste mit Nickelionen gekoppelt ist, die allgemein als Nickelsäule bekannt sind.

Die NEBExpress-Nickelsäulenpackung (S1428S) wurde im November 2019 neu eingeführt. Es gibt auch eine vorgepackte Spin-Säulenform (S1427S / L), die sich besser für die Reinigung kleiner Proteine im Screening-Stadium eignet. Die Reinigung von 1 mg His-markiertem Protein dauert nur 15 Minuten.

Jede Packung mit 1 ml Nickelsäule kann ≥ 10 mg Histidin-markiertes Protein reinigen;

Hochspezifische Bindung an Proteine mit His-Tag, Reinheit> 95% nach Trennung und Reinigung;

Die starke Nickelionenbindung macht es extrem resistent gegen EDTA und Reduktionsmittel und ist mit gängigen Zelllysereagenzien auf Waschmittelbasis kompatibel.