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PCR-Klonierungsprimer-Designmethode

Updatezeit : 2020-08-17

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PCR-Klonierungsprimer-Designmethode

Das PCR-Klonen ist eine molekularbiologische Technologie, die spezifische DNA-Fragmente amplifiziert und erweitert und in der Molekularbiologie und verwandten Bereichen weit verbreitet ist.

Unter diesen ist der PCR-Klonierungsprimer ein wichtiger Faktor im Prozess der PCR-Expansionsreaktion. Bevor das PCR-Klonierungsexperiment offiziell gestartet wird, ist es daher eine notwendige Fähigkeit, die richtige PCR-Klonierungsprimer-Designmethode zu beherrschen.


Designprozess des PCR-Klonierungsprimers:


Erhalten Sie eine PCR-Erweiterungsfragmentsequenz: Erweitern Sie im ersten Fall basierend auf bekannten Fragmenten, und Sie müssen PCR-Erweiterungsprimer durch NCBI-Suche nach Gensequenzen entwerfen. Wenn Sie unbekannte Genfragmente erweitern, müssen Sie nach konservativen Sequenzen verwandter Spezies suchen, die auf konservativen Sequenzen wie DNA oder RNA als Vorlage für das Design von Primern basieren.


Zum Beispiel ist die Primer Design-Software Prime Premier 5.0 leistungsstark und einfach zu bedienen. Es kann das Design von Primern vergleichen und umfassend bewerten. Es ist eine der am häufigsten verwendeten Software für das Primer-Design.


Überprüfung des PCR-Verlängerungstests: Die PCR-Amplifikation kann nach Abschluss der Primersynthese durchgeführt werden, und die Richtigkeit der PCR-Klonierungsprimer kann anhand der Länge des amplifizierten Produkts durch Gelelektrophorese vorhergesagt werden.


Vorsichtsmaßnahmen für das Design des PCR-Klonierungsprimers:


Die Primerlänge wird grundsätzlich zwischen 18 und 24 bp gehalten. Wenn die Länge der Primersequenz zu kurz ist, kann sie sich ausdehnen und die Expansionsrate der PCR-Klonierung beeinflussen. Wenn die Länge des Primers zu lang ist, kann die Primerreduktion nicht erhöht werden, aber die zu lange Sequenz führt zu Fehlpaarungen und verringert die Expansionsrate der PCR-Klonierung.


Daher beträgt der geeignete Tm-Wert 55-80 ° C, und die Initiierungstemperaturdifferenz zwischen den stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Primern sollte innerhalb von 10 ° C liegen.

Daher beeinflusst der GC-Gehalt der Verlängerung die Schmelztemperatur des Oligonukleotids während des PCR-Klonierungsprozesses, dh den Tm-Wert.

Im Allgemeinen liegt der GC-Gehalt der Verlängerung zwischen 40% und 60%, und der GC-Gehaltsunterschied zwischen den stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Primern liegt innerhalb von 20%, was den Primergehalt erhöhen kann.



In diesem Fall können während des PCR-Prozesses Fehlpaarungen auftreten, die die Genauigkeit der PCR-Amplifikation beeinträchtigen.

Verhindern Sie, dass der Einzelstrang des Amplifikationsprimers während des PCR-Klonierungsprozesses eine Sekundärstruktur bildet, und hemmen Sie den PCR-Expansionsprozess.


Die Plattform von Generalbiosystems verwendet eine patentierte Klonierungstechnologie, um Kunden dabei zu helfen, das Zielgen an einer bestimmten Position auf dem gewünschten Vektor zu klonen, ohne sich auf Vektorrestriktionsstellen zu verlassen, um verschiedene Klonierungsdesignpläne für Kunden zu erfüllen.