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PCR-Klonierungsmethode | Vorteil | Nachteile

Updatezeit : 2020-08-04

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PCR-Klonierungsmethode | Vorteil | Nachteile

Der Unterschied zwischen PCR-Klonierung und herkömmlicher Klonierung besteht darin, dass sie Ziel-DNA-Fragmente oder sogar Vektoren durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifizieren und ohne Verwendung von Restriktionsenzymen zusammen ligieren kann.

Das PCR-Klonen ist eine schnelle Methode zum Klonen von Genen, die normalerweise für Projekte verwendet wird, die einen höheren Durchsatz erfordern, und der Durchsatz dieser Projekte ist höher als der herkömmlicher Klonierungsmethoden. Es ermöglicht die Klonierung von DNA-Fragmenten, die nicht in großen Mengen verfügbar sind.


Normalerweise wird eine PCR-Reaktion durchgeführt, um die interessierende Sequenz zu amplifizieren, und dann wird sie vor der Transformation durch Überhangligatur mit stumpfem Ende oder einzelner Base mit dem Vektor verbunden.

Die frühe PCR-Klonierung von Taq-DNA-Polymerase wird häufig zur Amplifikation des Gens verwendet.

Dies führt zu einem PCR-Produkt, bei dem ein einzelner Adenin (A) -Rest durch normale Wirkung der Polymerase zum 3'-Ende des PCR-Produkts hinzugefügt wird, das von der Matrize unabhängig ist.

Diese "A-Schwanz" -Produkte werden dann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an einen komplementären T-Schwanz-Vektor ligiert und dann transformiert.


Heutzutage werden DNA-Polymerasen mit hoher Wiedergabetreue auch häufig verwendet, um Sequenzen zu amplifizieren, die keine 3'-Verlängerungs-PCR-Produkte enthalten.

Das Fragment mit stumpfen Enden wird durch eine typische Ligationsreaktion oder durch die Wirkung eines "aktivierten" Vektors, der ein kovalent ligiertes Enzym (üblicherweise Topoisomerase I) enthält, an den Plasmidvektor ligiert, was die Vektor: Insert-Ligation erleichtert .

Einige PCR-Klonierungssysteme enthalten manipulierte "Suizid" -Vektoren, die ein toxisches Gen enthalten, an das das PCR-Produkt erfolgreich ligiert werden muss, um die Vermehrung von Stämmen zu ermöglichen, die das rekombinante Molekül während des Transformationsprozesses absorbieren.


Ein typisches Manko vieler PCR-Klonierungsmethoden besteht darin, dass spezielle Vektoren verwendet werden müssen.

Diese Vektoren werden normalerweise von Anbietern (wie z. B. NEB) in gebrauchsfertigen linearisierten Formaten verkauft und können die Gesamtkosten für das Klonen erheblich erhöhen.

Ebenso begrenzt die Verwendung von spe cific Vektoren , welche die Möglichkeiten der Forscher für Antibiotika - Resistenz, Promoter Identität, Fusionspartner und andere regulatorische Elemente.

Vorteil der PCR-Klonierung :


✧ Effizient mit dediziertem Netzbetreiber
Geeignet für hohen Durchsatz

Nachteile der PCR-Klonierung :

Begrenzte Vektorauswahl
höhere Kosten
Fehlende Sequenzkontrolle an der Kreuzung
✧ Das Klonen mehrerer Fragmente ist nicht einfach
✧ Das gerichtete Klonen ist schwierig