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Wie gehe ich mit Einschlusskörpern in Proteinexpressionsexperimenten um?

Updatezeit : 2021-01-05

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Wie gehe ich mit Einschlusskörpern in Proteinexpressionsexperimenten um?
Auf welche Probleme stößt die Proteinexpression häufig? Einschlusskörper sind einer von ihnen. Bei den meisten Experimenten sind Einschlusskörper wie Hähnchenrippen. Dies ist jedoch häufig ein Problem, das bei der prokaryotischen Proteinexpression behandelt werden muss.

Der beste Weg ist natürlich, das Auftreten von Einschlusskörpern zu vermeiden, aber es gibt auch viele Proteine, die während der prokaryotischen Expression nicht in der Überstandsform erhalten werden können. Zu diesem Zeitpunkt ist die Renaturierung von Einschlusskörpern in aktive Proteine die beste Wahl.
怎样 处理 蛋白 表达 实验 中 出现 的 包涵体?

Trennung und Waschen von Einschlusskörpern

Einschlusskörper haben eine höhere Dichte als andere Komponenten, so dass sie durch Zentrifugation gesammelt werden können. Nach der Behandlung der Bakterien mit Lysozym werden die Zellen normalerweise durch Hochdruckhomogenisierung zerstört.

Da Liposomen und teilweise gebrochene Zellmembranen und Membranproteine an den Einschlusskörpern haften können, müssen die Einschlusskörper vor der Denaturierung und Auflösung gewaschen werden, üblicherweise mit einer geringen Konzentration an Denaturierungsmittel wie 0,5-1 M Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff.

Darüber hinaus können Sie auch mit einem milden Reinigungsmittel 1% TritonX-100 oder Natriumdesoxycholat waschen, um Membranfragmente und Membranproteine zu entfernen.

Einschlusskörperdegeneration

Resuspendieren und inkubieren Sie die Einschlusskörper in Puffer, der Denaturierungsmittel und Reduktionsmittel enthält (normalerweise 20 mM DTT oder β-Mercaptoethanol). Die Zugabe von Reduktionsmittel kann Cys in einem reduzierten Zustand halten. Es kann auch Disulfidbindungen in Proteinen aufbrechen.

Die Inkubationstemperatur während des Denaturierungsprozesses wird üblicherweise bei 30 ° C gehalten, um die Proteinauflösung zu fördern. Die Optimierung verschiedener Bedingungen in diesem Prozess wird durch die Eigenschaften des spezifischen Proteins bestimmt, und es kann ein Experiment im kleinen Maßstab durchgeführt werden, um die besten Auflösungsbedingungen zu finden.
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Wie gehe ich mit Einschlusskörpern in Proteinexpressionsexperimenten um?

Das Folgende sind die experimentellen Bedingungen für die Denaturierung im Allgemeinen:

Nachdem die Denaturierung der Einschlusskörper abgeschlossen ist, ist eine Zentrifugation erforderlich, um die verbleibenden unlöslichen Stoffe zu entfernen. Andernfalls können die verbleibenden unlöslichen Stoffe während des Rückfaltungsprozesses des Zielproteins eine Proteinaggregation und -ausfällung verursachen. Für die Zentrifugation ist es am besten, Ultrazentrifugation (100000 g, 30 Minuten) zu verwenden.

Rückfaltung von löslichem Protein

Der erste Schritt der Renaturierung besteht darin, das Denaturierungsmittel zu entfernen. Die wichtigsten ungünstigen Faktoren bei der Renaturierung von Proteinen sind die Fehlfaltung und Ausfällung von Proteinen.

Um die Ausfällung von Protein während des Renaturierungsprozesses zu verhindern, ist es notwendig, die Proteinkonzentration zu reduzieren, und der Proteinkonzentrationsbereich wird innerhalb von 10-100 mg / ml gesteuert.

Für verschiedene Proteine müssen die Renaturierungsbedingungen optimiert werden. Die wichtigen Faktoren beim Renaturierungsprozess sind wie folgt:
  • Pufferzusammensetzung (pH, Konzentration);
  • Temperatur;
  • Additive (normalerweise werden mehrere Additive zusammen verwendet).

Das Denaturierungsmittel und das Reduktionsmittel werden entfernt, und das denaturierte Proteinmolekül wird mit einer korrekten Rückfaltungs- und Aktivitätswiederherstellungsumgebung versehen, und das natürliche aktive Protein kann erhalten werden. Die am häufigsten verwendeten Renaturierungsmethoden sind Dialyse, Verdünnung, Chromatographie und so weiter.

Die Dialyse ist die in Laboratorien am häufigsten verwendete Methode, dauert jedoch lange und bildet leicht inaktive Proteinaggregate. MaedaY entwickelte eine langsame Dialysemethode, bei der 8 mol / l Harnstofflösung als Ausgangsdialysat verwendet und dann die harnstofffreie Lösung schrittweise erhöht wurde, um die Denaturierungsmittelkonzentration zu verringern.

Bei diesem Verfahren nimmt die Denaturierungsmittelkonzentration kontinuierlicher und langsamer ab, und es gibt keine Mutation in der Denaturierungsmittelkonzentration bei dem Verdünnungsverfahren, was dazu beitragen kann, die Ausfällung während der Renaturierung bestimmter Proteine zu verringern und die Ausbeute an aktiven Proteinen zu erhöhen. Mit dieser Methode erreichte die Renaturierungsrate von IgG 70% bei 1 mg / ml.

Die Verdünnung ist die einfachste und effektivste Methode zum Rückfalten. Nach der Verdünnung, wenn das Denaturierungsmittel und das Reduktionsmittel auf eine bestimmte Konzentration abfallen, beginnen sich die Proteinmoleküle wieder zu falten, aber die Menge der verarbeiteten Flüssigkeit ist groß, was der industriellen Amplifikation nicht förderlich ist. Die derzeitigen Verdünnungsmethoden umfassen hauptsächlich einmalige Verdünnung, segmentierte Verdünnung und serielle Verdünnung.

Die chromatographische Renaturierung ist eine Renaturierungsmethode, die häufiger untersucht wurde. Chromatographiesäulen werden verwendet, um Denaturierungsmittel zu entfernen. Üblicherweise verwendete chromatographische Verfahren umfassen Molekularsiebe, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie.

Wenn das Protein langsam in der Säule wandert, kann das Denaturierungsmittel entfernt werden oder das Protein wird an die Chromatographiesäule gebunden und vom Denaturierungsmittel getrennt. Die chromatographische Renaturierung wird üblicherweise für die Renaturierung von Proteinen in großem Maßstab verwendet, und die Renaturierungsproteinkonzentration reicht bis zu mg / ml.


Wenn Sie im Experiment auf zu viele Einschlusskörper stoßen, können Sie auch die oben genannten Methoden ausprobieren. Wenn Sie es immer noch nicht lösen können, können Sie auch Generalbiosystems in Betracht ziehen, um Ihnen zu helfen. Wir sind ein professionelles Unternehmen für die Herstellung rekombinanter Proteine.