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Methoden und Vorsichtsmaßnahmen zur Proteinreinigung

Updatezeit : 2020-10-26

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Methoden und Vorsichtsmaßnahmen zur Proteinreinigung
Der erste Schritt in der Proteinforschung besteht darin, das Zielprotein von einer komplexen Mischung von Makromolekülen zu trennen und zu reinigen, um ein hochreines Ziel mit biologischer Aktivität zu erhalten. Effiziente Proteinreinigungstechniken und -methoden sind daher eine der wichtigsten Grundlagen und Schlüssel der Proteinforschung.

Proteinextraktions- und Reinigungsmethode

Extraktion von Protein (einschließlich Enzymen)

Die meisten Proteine sind in Wasser, verdünntem Salz, verdünnter Säure oder Alkalilösungen löslich, und einige an Lipide gebundene Proteine sind in organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Aceton, Butanol usw. löslich. Daher können verschiedene Lösungsmittel zur Extraktion, Trennung und Verwendung verwendet werden Reinigung. Protein und Enzyme.

(1) Extraktionsverfahren mit wässriger Lösung

Die wässrige Lösung des verdünnten Salz- und Puffersystems weist eine gute Stabilität und eine hohe Löslichkeit für Protein auf. Es ist das am häufigsten verwendete Lösungsmittel für die Proteinextraktion.

Die übliche Menge beträgt das 1-5-fache des Volumens des Rohmaterials. Die Extraktion erfordert ein gleichmäßiges Rühren, um die Proteinauflösung zu erleichtern. Die Extraktionstemperatur hängt von der Art der Wirkstoffe ab.


Einerseits nimmt die Löslichkeit der meisten Proteine mit steigender Temperatur zu. Höhere Temperaturen begünstigen daher die Auflösung und verkürzen die Extraktionszeit.

Andererseits denaturiert und inaktiviert der Temperaturanstieg das Protein. Basierend auf diesem Punkt verwendet die Extraktion von Proteinen und Enzymen daher im Allgemeinen einen Betrieb bei niedriger Temperatur (unter 5 Grad).

Um einen Abbau während der Proteinextraktion zu vermeiden, können proteolytische Enzyminhibitoren (wie Diisopropylfluorphosphat, Iodessigsäure usw.) zugesetzt werden.



(2) Extraktionsverfahren für organische Lösungsmittel

Einige Proteine und Enzyme, die fester an Lipide gebunden sind oder unpolare Seitenketten im Molekül aufweisen, sind in Wasser, verdünnten Salzlösungen, verdünnten Säuren oder verdünnten Alkalien unlöslich.

Organische Lösungsmittel wie Ethanol, Aceton und Butanol können verwendet werden. Es hat eine gewisse Hydrophilie und starke Lipophilie. Es ist eine ideale Lipoproteinextraktionslösung. Es muss jedoch bei niedrigen Temperaturen betrieben werden.


Das Butanolextraktionsverfahren ist besonders überlegen, um einige Proteine und Enzyme zu extrahieren, die fest an Lipide gebunden sind. Eines ist, dass Butanol eine starke Lipophilie aufweist, insbesondere seine Fähigkeit, Phospholipide aufzulösen; Das andere ist, dass Butanol sowohl hydrophil ist als auch innerhalb des Löslichkeitsbereichs liegt.

(Grad ist 10%, 40 Grad ist 6,6%) verursacht keine Enzymdenaturierung und Inaktivierung. Darüber hinaus bietet das Butanolextraktionsverfahren eine Vielzahl von pH- und Temperaturoptionen und ist auch für tierische, pflanzliche und mikrobielle Materialien geeignet.


Vorsichtsmaßnahmen für die Proteinextraktion und -reinigung:


Wenn Sie irgendeine Art von Protein reinigen, müssen Sie immer darauf achten, dass es stabil bleibt und seine Aktivität schützt. Es sind einige allgemeine Vorsichtsmaßnahmen zu beachten. Sie beinhalten:

1. Der Betrieb sollte so weit wie möglich auf Eis oder in einem Kühlraum erfolgen.

2. Seien Sie nicht zu verdünnt und halten Sie die Proteinkonzentration bei μg / ml ~ mg / ml.

3. Richtiger pH-Wert, sofern keine Fokussierungschromatographie durchgeführt wird, sollte die verwendete Pufferlösung den gleichen pH-Wert wie der pI vermeiden, um eine Proteinfällung zu verhindern.

4. Verwenden Sie Proteaseinhibitoren, um zu verhindern, dass die Protease das Zielprotein abbaut. Wenn Sie das Protein in der Zelle reinigen, fügen Sie DNase hinzu, um die DNA abzubauen und zu verhindern, dass DNA das Protein kontaminiert.

5. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen sowie heftiges Rühren der Probe, um eine Denaturierung des Proteins zu verhindern.

6. Die Komponenten der Pufferlösung ahmen die intrazelluläre Umgebung so weit wie möglich nach.

7. Fügen Sie der Pufferlösung 0,1 bis 1 mmol / LDTT (Dithiothreit) (oder β-Mercaptoethanol) hinzu, um eine Proteinoxidation zu verhindern.

8. Fügen Sie 1 ~ 10 mmol / LEDTA-Metallchelatbildner hinzu, um zu verhindern, dass Schwermetalle das Zielprotein beschädigen.

9. Verwenden Sie eine Sterilisationslösung, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.

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