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Gensynthesemethoden

Updatezeit : 2020-08-25

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Gensynthesemethoden

Gensynthesemethoden umfassen hauptsächlich Assemblierungs- PCR , Überlappungsverlängerungs-PCR, TBIO-Methode und PTDS-Methode.


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Vor der Gensynthese führen die Forscher normalerweise eine Codonoptimierung an Genen durch, damit Gene in verschiedenen biologischen Expressionssystemen gut exprimiert werden können.

Es gibt 64 genetische Codes, aber die meisten Organismen neigen dazu, einige dieser Codons zu verwenden. Diejenigen, die am häufigsten verwendet werden, werden als optimale Codons bezeichnet, und diejenigen, die nicht häufig verwendet werden, werden als seltene oder wenig genutzte Codons bezeichnet.


Tatsächlich weist jeder zur Proteinexpression oder -produktion verwendete Organismus (einschließlich E. coli, Hefe, Säugetierzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen) einen bestimmten Grad an Codonpräferenz auf.

Daher kann die Expression von rekombinanten Proteinen durch Codons beeinflusst werden. Die Auswirkungen der Nutzung von Kindern (insbesondere in heterologen Expressionssystemen).


Ohne das codierende Protein zu ändern, wird der Prozess des Änderns des codierenden Gens eines Proteins, des Entfernens seltener Codons und der angemessenen Optimierung seiner mRNA-Sekundärstruktur, seines GC-Gehalts usw. als Codonoptimierung bezeichnet.

Das Prinzip der Codonoptimierung besteht darin, unterschiedliche Codons für jede Aminosäure in der Zielproteinsequenz gemäß der Codonpräferenz des Expressionssystems auszuwählen, das verwendet werden soll, um die Kombination der gesamten Sequenz durchzuführen und die beste zu finden.


1. Primersynthese
Nachdem die Forscher die synthetische Gensequenz nach ihren eigenen Wünschen bestimmt haben, müssen sie, da es kein Template gibt, zunächst Primer entwerfen und synthetisieren, die auf der zu synthetisierenden doppelsträngigen DNA basieren.
Gegenwärtig wird bei der Primersynthese im Wesentlichen das Festphasen-Phosphoramidit-Triester-Verfahren angewendet. Das Phosphoramidit-Triester-Verfahren zur Synthese von DNA-Fragmenten weist die Eigenschaften einer hohen Effizienz, einer schnellen Kopplung und relativ stabiler Anfangsreaktanten auf.
2. PCR-Amplifikation mit Primern als Matrizen
Nach der Synthese der Primer dienen die Primer als Matrizen für die PCR-Amplifikation. Das Grundprinzip der PCR-Technologie ähnelt dem natürlichen Replikationsprozess von DNA, und seine Spezifität beruht auf Oligonukleotidprimern, die zu beiden Enden der Zielsequenz komplementär sind.
3. Verbindungstransformation, Bakterieninspektion und -prüfung
Durch die PCR-Reaktion kann die benötigte doppelsträngige DNA amplifiziert werden. Die Stabilität des PCR-Produkts ist jedoch gering. Wir müssen es an das Plasmid binden, es in einen kompetenten Zustand überführen und über Nacht auf einer Platte verteilen. Die positiven Klone können am nächsten Morgen von der Platte entnommen werden. Die ausgewählten Klone müssen erneut durch Kolonie-PCR verifiziert werden, um zu überprüfen, ob eine Geninsertion in voller Länge vorliegt. Die PCR wird mit den Kopf- und Schwanzprimern durchgeführt. Wenn es ein Produkt gibt, zeigt dies an, dass es ein Zielgen gibt. Die verifizierten Klone werden in Reagenzglas-Kultur-Shake-Bakterien transformiert, wonach die Plasmide extrahiert, gereinigt und zur Sequenzierung geschickt werden.
4. Sequenzierung der ersten Generation
Derzeit verwenden wir die Sequenzierung der ersten Generation, auch Sanger-Sequenzierung genannt. Bei der Sanger-Sequenzierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen an eine Matrize einer anstehenden Sequenz gebundenen Primer zu verlängern, bis ein kettenendendes Nukleotid eingebaut ist. Jede Sequenzbestimmung besteht aus einem Satz von vier getrennten Reaktionen, die jeweils alle vier Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) enthalten, gemischt mit einer begrenzten Menge eines anderen Didesoxynukleotidtriphosphats (ddNTP).
5. QC-Überprüfung

Das Sequenzierungsergebnis wird mit dem Zielgen verglichen, und gleichzeitig wird die Überprüfung des QC-Enzymverdaus durchgeführt. Wenn das Sequenzierungsergebnis und das Ergebnis der Verdauungsverifizierung korrekt sind, ist die Synthese des Zielgens abgeschlossen. Gemäß den obigen Schritten kann eine Gensequenz von etwa 800 bp in 5 Tagen unter glatten Bedingungen synthetisiert werden.