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Vier Ansätze des Subklonens

Updatezeit : 2020-08-06

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Vier Ansätze des Subklonens
Aus der Sicht eines Unternehmens , das in spezialisierten Dienstleistungen Subklonierung , generalbiosystems werden Sie Antworten liefert auf den durch Subklonieren verwendete Ansätze.

✦ Restriktionsverdauung

Limitationsendonukleasen (RE), die zusätzlich als Restriktionsenzyme bezeichnet werden, sind Proteine, die kurze, detaillierte (typischerweise palindromische) DNA-Reihen identifizieren. REs vom Typ II spalten doppelsträngige DNA (dsDNA) an bestimmten Websites innerhalb oder neben ihren Erkennungssequenzen.

Viele Begrenzungsenzyme werden sicherlich nicht die DNA reduzieren, die an einem oder beiden Haaren der Bestätigungsstelle methyliert ist, obwohl einige eine Methylierung des Substrats fordern.


Teilbeschränkungsverdauung

Steuern der Schnittfrequenz bei der Restriktionsverdauung

Die Sichtbarkeit einer Beschränkungserkennungswebsite in der Einfügung und auch der Mehrfachklonierungsregion verhindert nicht notwendigerweise die Verwendung dieser Beschränkungswebsite in einer Subklontechnik. Unter typischen Restriktionsabsorptionsbedingungen ist das Enzym im Überschuss, um sicherzustellen, dass alle Bestätigungsstellen im Plasmid gespalten werden können.

Sie können die Bedingungen für die Einschränkungsverdauung so ändern, dass Sie mit Sicherheit nur einen Teil der Websites verarbeiten.

Viele Ansätze wurden tatsächlich verwendet, um Teilverdauungen durchzuführen: Verringern des Reaktionstemperaturniveaus, Verwenden einer nicht optimalen Barriere und Verringern von Enzymsystemen.


Dephosphorylierungsvektoren zur Begrenzung der Selbstligation

Das Stoppen der Vektor-Selbstligation ist wichtig, um die Subklonierungshistorie zu reduzieren. Die Effizienz der Ligierung des Plasmids an sich selbst ist viel besser als die Ligierung eines separaten DNA-Stücks direkt in den Vektor und ist die bevorzugte Antwort. Das Entfernen der 5'-Phosphate des linearisierten Vektors verhindert, dass die T4-DNA-Ligase den Vektor rezirkularisiert. Calf Intestinal Alkaline Phosphatase ist das zeitlose Enzym für die Vektordephosphorylierung.

Das Enzym kann an 5'-vertieften Enden (dh entsteht aus einem Enzym, das einen 3'-Überhang hinterlässt), 5'-Überhängen sowie stumpfen Enden verwendet werden.

Nach der Dephosphorylierung muss das Enzym entweder durch direkte Reinigung oder Gelelektrophorese sowie durch Gelabgeschlossenheit mit DNA-Filtrationssystemen wie dem Gel- und PCR-Reinigungssystem eliminiert werden.

Alkalische Phosphatase aus Garnelen kann anstelle von alkalischer Phosphatase aus dem Wadenknochen-Darmtrakt verwendet werden und bietet den Vorteil einer einfachen Denaturierung der Wärme, um das Enzym zu suspendieren, ohne dass eine weitere Filtration erforderlich ist.


Reinigen des Vektors sowie Einfügen

Die Filtration des Inserts sowie der Positionsvektor sind für den Erfolg bei Subklonierungsanwendungen unbedingt erforderlich.

Vor Jahren erforderte jeder Schritt Phenol: Chloroform-Extraktionen, an denen Ethanolregen haftete, um Enzyme wie die alkalische Phosphatase des Kalbsverdauungsmittels aus chemischen Vektorkontrollen zu entfernen.

Nukleinsäurereinigungssysteme auf Guanidinbasis vereinfachten die Eliminierung von Enzymen erheblich.

Gelisolierungsansätze verbesserten die Wirksamkeit der Subklonierung noch mehr, indem die gewünschten Katalysatoren von den unerwünschten Reaktanten getrennt wurden.