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Faktoren, die die Proteinexpression beeinflussen

Updatezeit : 2020-10-27

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Faktoren, die die Proteinexpression beeinflussen

Bei der Durchführung von Proteinexpressionsexperimenten hat das Experiment manchmal das Gefühl, dass es kein Problem mit der Referenzversuchsmethode und der klonierten Proteingensequenz gibt, und die Proteinelektrophorese hat keine Ergebnisse.

Die Gründe, warum das Protein nicht exprimiert wird, sind zusammengefasst.


1. Falsche Vektorkonstruktion. Dies ist nicht ungewöhnlich und viele neue Kloner verwechseln häufig den Leserahmen. Beispielsweise weisen die Vektoren der pQE-Reihe von Qiagen häufig einen Unterschied von einer oder zwei Basen in ihren Klonierungsstellen auf; Darüber hinaus produzieren einige Enzyme klebrige Enden und einige Enzyme stumpfe Enden, was leicht zu Leserahmenfehlern führen und somit nicht exprimieren kann.

2. Unsachgemäße Auswahl der Wirtsbakterien. Verschiedene Wirtsbakterien haben unterschiedliche Genotypen.

Für einige speziell modifizierte Vektoren oder Spezialvektoren oder Vektoren mit speziellen Promotoren müssen geeignete Wirtsbakterien zur Expression ausgewählt werden.


Wenn Ihr Protein nicht exprimiert wird, können Sie daher in Betracht ziehen, die Wirtsbakterien zu ersetzen.


3. Die Häufigkeit der Codonverwendung ist gering. Einige Gene selbst enthalten viele seltene Codons, insbesondere die seltenen Codons innerhalb von 15 Basen nach dem Startcodon, die einen sehr wichtigen Einfluss auf die Proteinexpression haben. Optimierte Codons scheinen einen guten Effekt auf die prokaryotische Expression zu haben, haben jedoch keinen guten Effekt auf eukaryotische Expressionssysteme gesehen.

4. Das Plasmid ist instabil oder geht verloren. pET-Systeme sind normalerweise relativ stabil. Wenn Sie jedoch einen Vektor mit Ampicillinresistenz wählen, kann möglicherweise β-Galactosidase produziert werden, die das Antibiotikum abbaut und das Plasmid verliert.

Eine andere Situation ist die Expression von rekombinantem Toxinprotein, das auch für Wirtszellen toxisch ist und einen Plasmidverlust verursacht. Diese Situation ist in eukaryotischen Expressionssystemen häufiger.


5. Die Protease baut das Protein ab. Diese Situation wird häufig durch die N- oder C-terminale Sequenz des rekombinanten Proteins selbst verursacht. Wenn der N-Terminus des Proteins Arg, Leu, Lys, Phe, Trp oder Tyr ist, neigen diese Aminosäuren zum Abbau von Proteasen, was die N-terminale Regel ist.

Wenn der N-Terminus Met ist, kann E. coli dieses Met leise stehlen, insbesondere wenn auf Met eine Aminosäure mit einer kleinen Seitenkette folgt.

Das Vorhandensein unpolarer Aminosäuren am C-Terminus kann auch leicht zum Proteinabbau führen. Die letzten 5 Aminosäuren am C-Terminus sind polar oder geladen und werden nicht leicht abgebaut.


6. Startseite für die sekundäre Übersetzung. Dies ist der Fall, wenn Ihre Sequenz genau dieselbe Sequenz enthält wie die Ribosomenbindungsstelle.

Das Ribosom findet diese Stelle und beginnt mit der Translation, wodurch Ihr Protein verkürzt wird und Fragmente der erwarteten Größe während der Elektrophorese nicht sichtbar sind.


7. SD-Sequenz. Der Abstand zwischen der SD-Sequenz und der Startcodonsequenz (80% sind AUG und GUG) hat ebenfalls einen sehr wichtigen Einfluss auf die Effizienz der Proteinexpression.

Die Zusammensetzung der SD-Sequenz selbst beeinflusst auch die Translationseffizienz. Manchmal wird die SD-Sequenz speziell modifiziert, um die Produktion von Einschlusskörpern zu reduzieren!


8. Die Sekundärstruktur von mRNA. Vor dem Klonieren müssen Sie prüfen, ob in Ihrer Sequenz eine Sequenz vorhanden ist, die zur Ribosomenbindungsstelle und / oder Translationsstartstelle komplementär ist.

9. Unerwartete Kündigung. Diese Situation wird bei der PCR-Amplifikation von Sequenzen gesehen. Zum Beispiel mutiert es die TAC in der Mitte der Sequenz zu TAA, was Ihre Proteintranslation bremst.

Daher muss die Sequenzierung vor der Expression durchgeführt werden, um diese Situation zu vermeiden.


10. Transkriptionsterminator. Die Existenz eines Transkriptionsterminators kann die Proteinexpression fördern; aber wenn es fehlt, wird es "durchlesen" und endlos lesen.

Dies ist im pET-System kein Problem, da es ein selektives Markergen in der entgegengesetzten Richtung des Zielgens aufweist.

Wenn Ihr Zielgen zufällig in die gleiche Richtung wie dieses Markergen weist, müssen Sie prüfen, ob sich nach Ihrem Zielgen ein Transkriptionsterminator befindet.


11. Die Instabilität von mRNA. Die mRNA des Zielgens reichert sich häufig in der Zelle an. Die mRNA coliformer Bakterien ist jedoch äußerst instabil.

Wenn eine stabile Struktursequenz in die 5'-untranslatierte Region und den 3'-Rho-unabhängigen Terminator der mRNA eingefügt wird, kann die Stabilität der mRNA gefördert werden.

Insbesondere wenn das 5'-Ende eine Haarnadelstruktur aufweist, ohne hervorzustehen, kann es die mRNA im Zytoplasma leblos machen.


12. Die Machbarkeit der Nachweismethode. Manchmal wird das Protein zwar exprimiert, aber das Expressionsniveau ist extrem niedrig oder es liegt so nahe an der verschiedenen Bande, dass Sie fälschlicherweise glauben, dass das Protein nicht exprimiert wird.

Zu diesem Zeitpunkt dürfen Sie die beiden goldenen Regeln biologischer Experimente nicht vergessen: Kontrolle und Wiederholung.



Zusammenfassend sind alle experimentellen Materialien sehr wichtig. Die korrekte Konstruktion von Proteinexpressionsvektoren ist die Grundlage für Proteinexpressionsexperimente.

Daher muss die Richtigkeit der Proteinexpressionsvektoren sichergestellt werden. Ein geeignetes Wirtsbakterium ist auch die Grundlage für Proteinexpressionsexperimente.


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