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Gemeinsame Subklonierungsstrategien

Updatezeit : 2020-08-05

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Gemeinsame Subklonierungsstrategien

Um die gewünschte Funktionalität eines Inserts zu untersuchen, müssen sie von einem Vektor auf einen anderen übertragen werden. Dieses Übertragungsverfahren wird als Subklonierung bezeichnet . Schritte des Subklonens:


  • Geben Sie Ihr Insert vom übergeordneten Vektor frei und reinigen Sie es
  • Ligiere dieses Insert in einen vorbereiteten Zielvektor
  • Transformieren Sie diese Ligationsreaktion in kompetente Bakterienzellen
  • Durchsuchen Sie die transformierten Zellen nach dem Insert

Verschiedene Subklonierungsstrategien:

Für alle Arbeiten zum Subklonen sind einige Kenntnisse über den Vektor und das Einfügen erforderlich.

Die Informationen über die RE-Stellen, die in den Mehrfachklonierungsregionen des Elternvektors verfügbar sind, RE-Stellen, die das Insert zur Verfügung stellen (im Falle eines Inset-Verdaus). Auch Informationen über das Wiederauftreten von RE-Stellen in Zielklonierungs-Mehrfachklonierungsregionen und RE-Stellen in der Insertion.

Abhängig von der unterschiedlichen Kombination dieser Sites wird die zu verwendende Subklonierungsstrategie festgelegt.


✦ Allgemeine Einschränkungsstellen

Ein unkomplizierter Subklonierungsprozess kann verwendet werden, wenn die Mehrfachklonierungsregionen des Eltern- und Zielvektors gemeinsame Restriktionsstellen enthalten und keine dieser Restriktionsstellen in Ihrer Insertion auftritt.

Sowohl der Eltern- als auch der Zielvektor werden unter Verwendung derselben zwei Enzyme verdaut. Darauf folgt die Dephosphorylierung des Zielvektors. Trennen Sie sowohl das Insert als auch den dephosphorylierten Vektor unter Verwendung eines Agarosegels. Reinigen Sie dann den Insert-Vektor unter Verwendung eines beliebigen DNA-Reinigungssystems. Schließlich werden diese Vektoren und Inserts ligiert.


Verschieben von Beilagen mit kompatiblen Einschränkungsstellen

  Es gibt Fälle, in denen Restriktionsstellen im Mehrfachklonierungsbereich des Eltern- und Zielvektors nicht häufig sind, aber möglicherweise kompatibel sind. Kompatible Restriktionsstellen haben die gleiche Überhangsequenz und können miteinander ligiert werden.

Nach der Ligation ähneln die regenerierten Stellen nicht beiden Restriktionsstellen in den Mehrfachklonierungsregionen des Eltern- und Zielvektors. Sobald die notwendigen Enzyme für die Ligation und Restriktion identifiziert sind. Diese Klonstrategie wird ebenfalls unkompliziert.


Verschieben von Beilagen mit nur einer gemeinsamen Site


Die Kombination gemeinsamer Restriktionsstellen führt dazu, dass nur eine Übereinstimmung auf einer Seite Ihres Inserts möglich ist. Das Problem sollte auf der anderen Seite der Beilage behoben werden. Ein Schnitt-Stumpf-Schnitt kann verwendet werden.

Die Wirkung von T4-DNA-Polymerase kann jede Restriktionsstelle stumpf machen. Verdauen Sie den Elternvektor und stumpfen Sie diese Stelle mit T4-DNA-Polymerase ab. Lassen Sie die Produkte auf einem Gel laufen, reinigen Sie sie und fahren Sie mit der üblichen oder kompatiblen Verdauung von Endrestriktionsenzymen fort.

Die meisten Vektoren haben mindestens eine Restriktionsstelle mit stumpfen Enden, die das neu erzeugte stumpfe Ende aus dem Insert aufnehmen kann.

Wenn Sie keine solche Site haben oder die Site nicht in der richtigen Ausrichtung ist, wird möglicherweise dieselbe Strategie „Cut-Blunt-Cut“ auf das Ziel angewendet.


Methode mit stumpfem Ende

Das letzte Szenario ohne gemeinsame Restriktionsstelle ist gemeinsam oder mit dem übergeordneten oder Zielvektor kompatibel.

In diesem Szenario besteht die beste Strategie darin, das Insert mit Restriktionsstellen in den Primern zu amplifizieren, um die Kompatibilität bereitzustellen. Diese Methode hat jedoch eine Reihe von Problemen.

Es besteht die Möglichkeit von Mutationen. Es gibt auch große Schwierigkeiten bei der Verdauung der PCR-Produkte. In diesem Szenario kann eine weitere Strategie verwendet werden. Schneiden Sie den Einsatz mit Enzymen aus.

Mit T4-DNA-Polymerase behandeln, um entweder 5'- oder 3'-Überhänge abzustumpfen, und in den Zielvektor ligieren, der mit einem Cutter mit stumpfem Ende geöffnet oder durch T4-DNA-Polymerase stumpf gemacht wurde. Die Ausrichtung des Isert kann durch diese Methode nicht beibehalten werden.