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Eigenschaften des E. coli-Expressionssystems

Updatezeit : 2020-12-10

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Eigenschaften des E. coli-Expressionssystems

Escherichia coli ist das erste Wirtsbakterium, das für die rekombinante Proteinexpression verwendet wird. Bisher gilt Escherichia coli immer noch als das Hauptinstrument auf dem Gebiet der Proteinexpression. Die Proliferationszeit von E. coli ist relativ kurz, so dass das E. coli-Expressionssystem ein schneller Weg wird. Normalerweise dauert die Expression rekombinanter Gene in E. coli nur weniger als 1 Woche.

Gleichzeitig hat das E. coli-Expressionssystem auch den Vorteil eines niedrigen Preises - das Kulturmedium von E. coli.

E. coli Protein  Expression System

Einschlusskörper

In E. coli befinden sich rekombinante Proteine normalerweise im Zytoplasma, können sich auch im Periplasma befinden und werden in einigen Fällen außerhalb der Zelle sekretiert. Die Expressionseffizienz von Proteinen im Zytoplasma ist am höchsten, und die Ausbeute kann normalerweise 30% der gesamten Biomasse ausmachen.

Eine Überexpression von rekombinantem Protein kann jedoch zur Akkumulation unlöslicher Proteinaggregate führen, wodurch Einschlusskörper gebildet werden.


Es sind nicht nur die von Eukaryoten abgeleiteten Proteine, die Einschlusskörper bilden, sondern in einigen Fällen kann die Überexpression von von Prokaryoten wie E. coli abgeleiteten Proteinen auch Einschlusskörper bilden.

In E. coli ist die Geschwindigkeit der Proteintranslation und -faltung fast zehnmal höher als in eukaryotischen Zellen, was der Grund sein kann, warum eukaryotische Proteine Einschlusskörper bilden. In einigen Fällen behindern Einschlusskörper die Verfügbarkeit von löslichem aktivem Protein erheblich.


Einschlusskörper haben auch bestimmte Vorteile. Normalerweise werden die Einschlusskörper durch Proteasen nicht leicht abgebaut, können durch Zentrifugation leicht konzentriert werden und sind selten durch andere Proteine kontaminiert. Durch bestimmte Mittel können die Einschlusskörper auch in aktive lösliche Proteine zurückgefaltet werden.
E. coli Protein  Expression System

Temperatur und molekulare Chaperone reduzieren die Bildung von Einschlusskörpern


Durch Verringern der Temperatur auf 15 bis 30 ° C während der Proteinexpression kann das rekombinante Protein so viel lösliches, korrekt gefaltetes Protein wie möglich bilden, während so wenige Einschlusskörper wie möglich gebildet werden.

Einige Spekulationen zeigen, dass eine Senkung der Temperatur die Geschwindigkeit der Proteintranskription, -translation und -faltung verringert, so dass sich das Protein korrekt falten kann. Gleichzeitig verringert eine niedrige Temperatur auch die Aktivität der Hitzeschockprotease.


Darüber hinaus fördern einige Forscher die Löslichkeit von Proteinen, indem sie Chaperone mit rekombinanten Proteinen im Zytoplasma coexprimieren. Die Verwendung von molekularen Chaperonen kann proteinspezifisch sein, daher müssen Experimente für jedes rekombinante Zielprotein separat durchgeführt werden.

Fusionsmarkierungen verbessern die Löslichkeit von rekombinanten Proteinen


Ein anderer Weg, um die Löslichkeit vieler rekombinanter Proteine zu verbessern, besteht darin, einen löslichen Fusionsmarker am N-Terminus oder C-Terminus des rekombinanten Proteins einzubauen.

Fusionsmarkierungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Löslichkeit von rekombinanten Proteinen verbessern, umfassen Glutathion-S-Transferase wie Thioredoxin, Maltose-bindendes Protein (MBP), niedermolekulares Ubiquitin-ähnliches modifiziertes Protein und NusA-Markierung (JV-Verwendungssubstrat).


Unter diesen haben das GST-Tag und das MBP-Tag zusätzliche Vorteile und können als Affinitätsreinigungs-Tags verwendet werden. Leider kann kein einzelnes Tag auf alle rekombinanten Proteine angewendet werden, und die Fähigkeit mehrerer Fusions-Tags, die lösliche Expression zu fördern, muss bewertet werden.


Es gibt viele Strategien zum Entfernen der Fusionsmarkierung des rekombinanten Proteins. Der übliche Ansatz besteht darin, eine Protease-Spaltstelle zwischen dem Fusions-Tag und dem rekombinanten Protein einzufügen und dann eine spezifische Protease zu verwenden, um es zu entfernen.

Manchmal kann das rekombinante Protein jedoch nach dem Entfernen der Markierung unlöslich werden, weshalb diese Methode sorgfältig getestet werden muss.


Bildung von Disulfidbindungen


Für die cytoplasmatische Expression kann E. coli normalerweise nicht die korrekte Bildung von Disulfidbindungen von rekombinanten Proteinen fördern; Aufgrund der Katalyse des Disulfidbindungsoxidoreduktase-Systems ist das Periplasma normalerweise der einzige Ort, an dem Disulfidbindungen in E. coli gebildet werden können.

Wenn das rekombinante Protein Disulfidbindungen bilden muss, muss daher ein spaltbares Signalpeptid (wie pelB) verwendet werden, um es im Periplasma zu lokalisieren. Einer der Hauptnachteile der periplasmatischen Expression besteht jedoch darin, dass die Menge der Proteinexpression stark verringert wird.


Thioredoxin und Glutaredoxin können die Reduktionsreaktion von Hemipteransäure im Zytoplasma fördern und das Thioredoxinreduktasegen und die Glutathionreduktasegruppe des D sb-Systems durch Modifikation des E. coli-Genoms zerstören. Es kann eine geeignetere Umgebung für die Bildung von Disulfidbindungen schaffen im Zytoplasma.

Diese gentechnisch veränderten Stämme wurden von EMI> Novagen kommerzialisiert. Wenn mehr Disulfidbindungen gebildet werden müssen, kann das rekombinante Protein mit Thioredoxin fusioniert und im trxB- / gor E. coli-Stamm exprimiert werden.