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Analyse häufiger Probleme bei der prokaryotischen Proteinexpression

Updatezeit : 2021-03-04

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Analyse häufiger Probleme bei der prokaryotischen Proteinexpression

Prokaryontische Expression bezieht sich auf das Verfahren zum Konstruieren eines Expressionsvektors und zum Einführen eines fremden Zielgens in einen Expressionsstamm durch Genklonierungstechnologie, so dass es in einem bestimmten prokaryotischen Organismus oder einer bestimmten prokaryotischen Zelle exprimiert werden kann. Das prokaryotische Proteinexpressionssystem ist derzeit die am häufigsten verwendete und wirtschaftlichste Proteinexpressionsmethode. Das Escherichia coli-Expressionssystem ist eines der am häufigsten verwendeten prokaryotischen Proteinexpressionssysteme.

Escherichia coli expression system Features

Ein vollständiges Expressionssystem umfasst üblicherweise unterstützende Expressionsvektoren und Expressionsstämme. Wenn es sich um eine speziell induzierte Expression handelt, enthält sie auch einen Induktor, und die Fusionsexpression umfasst auch ein Reinigungssystem oder einen Tag-Nachweis. Die Auswahl eines Expressionssystems hängt normalerweise vom Zweck des Experiments ab, wie z. B. dem Expressionsgrad, der Aktivität des Zielproteins, der Reinigungsmethode des Expressionsprodukts usw. Im Folgenden werden die häufigsten Probleme im prokaryotischen Expressionsprozess vorgestellt.

 

F: Warum erscheint das Zielprotein immer in Form von Einschlusskörpern?

A: Bei der prokaryotischen Expression und Reinigung faltet sich das Zielprotein häufig falsch und aggregiert zu Einschlusskörpern. Nach der Induktion kann die Expression des Zielproteins normalerweise mehr als 50% des gesamten Zellproteins erreichen.

Obwohl ein bestimmter Anteil des Proteins in löslicher Form vorliegt, sind bis zu 95% des Proteins in den Einschlusskörpern vorhanden. Um löslicheres Protein zu erhalten, kann während des Experiments die Induktionstemperatur beispielsweise auf 16 bis 30 ° C gesenkt oder die IPTG-Konzentration (0,01 bis 0,1 mM) verringert und die Induktionszeit verlängert werden. Ein spezielles Medium kann auch zur Kultivierung von Bakterien verwendet werden.



F: Warum ist es schwierig, Transmembranproteine zu exprimieren?

A: Die relativ niedrige Erfolgsrate der Transmembranproteinexpression ist ein häufiges Problem. Es kann zwei Hauptgründe geben:

 

1. Transmembranproteine bestehen im Allgemeinen aus starken hydrophoben Aminosäuremolekülen und hydrophilen Molekülen, die hüpfend verbunden sind, um die einfachste hydrophile und hydrophobe chemische Transmembranstruktur zu bilden, die der Struktur von Signalpeptiden ähnlich ist.

Bei prokaryotischen Zellen können einfache Organellen den komplexen Prozess der Erkennung und Entfernung von Signalpeptiden kaum abschließen und das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat dazu bringen, wie eukaryotische Zellen neu zu verpacken und abzusondern. Einige Proteine passieren die Membran mehrmals. Für prokaryotische Zellen Es ist fast unmöglich, dass die Zelle die Aufgabe erfüllt.


2. Bei hydrophoben Fragmenten bilden sich bei der Expression prokaryotischer Zellen leicht Einschlusskörper. Hydrophobe Peptide können den Translationsprozess hemmen und sogar mit der prokaryotischen Membranstruktur verschmelzen, um Toxizität zu bilden. Im Instinkt des biologischen Selbstschutzes stoppen alle Organellen den Prozess der Proteinsynthese.

 

Wenn Sie an diesem Thema interessiert sind, folgen Sie bitte weiterhin dem aktualisierten Artikel von Generalbiosystems zur Analyse häufiger Probleme bei der Expression prokaryotischer Proteine.