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Vorteile von Proteinreinigungsmethoden

Updatezeit : 2020-12-09

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Vorteile von Proteinreinigungsmethoden

Unabhängig davon, ob es sich um Proteinforschung oder -anwendung handelt, ist es normalerweise erforderlich, das Protein in verschiedenen biologischen Systemen (wie E. coli, Hefe, Insekten-Baculovirus, Säugerzell-Protein-Expressionssystem usw.) zu exprimieren und dann zu trennen und zu reinigen. Forschungslabors müssen normalerweise Mikrogramm oder Milligramm Protein reinigen, während die Industrie Tausende von Gramm oder sogar Tonnen Protein reinigen muss.


Mammalian cell protein

Daher ist die Proteinreinigung sehr wichtig. Während des Reinigungsprozesses müssen die Kontamination des Wirts, die Löslichkeit der Probe, die Integrität der Proteinstruktur und die biologische Aktivität berücksichtigt werden. Die Proteinreinigung kann grob in drei Stufen unterteilt werden: Probenerfassung, Zwischenreinigungsstufe und Feinreinigungsstufe.

Probenerfassung: Trennung, Konzentration und Stabilisierungsbehandlung;

Mäßige Reinigung: Um Nukleinsäure und andere zelluläre Komponenten zu entfernen, kann das Ammoniumsulfat-Fällungsverfahren verwendet werden.

Feinreinigung: Unterscheiden Sie das Zielprotein von anderen Proteinen mit ähnlicher Größe sowie ähnlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Übliche Verfahren umfassen Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie.

Richtlinie zur Proteinreinigung:


1. Klare Ziele, Überreinigung oder unzureichende Reinigung vermeiden;
2. Identifizieren Sie die Eigenschaften der Probe und die Hauptverunreinigungen und wählen Sie die geeignete Reinigungsmethode aus.
Die Kombination der Reinigungstechnologie kann schnell bestimmt werden, indem das Proteinstabilitätsfenster (wie pH-Wert, Ionenstärke) und grundlegende Proteindaten (wie Proteingröße, isoelektrischer Punkt pl, Hydrophobizität, Löslichkeit usw.) erfasst werden.

3. Es kann schnell die Wiederfindungsrate, Aktivität und Verunreinigungen des Proteins erkennen;

4. Minimieren Sie die Schritte, um übermäßigen Probenverlust und übermäßige Verringerung der Aktivität zu vermeiden.

5. Entfernen Sie Protease und andere Verunreinigungen, die die Probe beschädigen können, so bald wie möglich.

6. Minimieren Sie die Verwendung von Additiven. Andernfalls sind möglicherweise zusätzliche Schritte erforderlich, um Additive zu entfernen.
Escherichia coli expression system

Vorteile von 6 Proteinreinigungsmethoden:

Aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften von Proben und Proteinen und der darin enthaltenen Verunreinigungen sind unterschiedliche Proteinreinigungsstrategien erforderlich.

Derzeit gibt es sechs Proteinreinigungsverfahren: Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Tag-Reinigung, Affinitätschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Elektrophorese usw. Andere Verfahren können auch zur Proteinreinigung verwendet werden, wie beispielsweise die Verwendung von thermischer Stabilität, proteolytischer Stabilität und Löslichkeit des Proteins zur Reinigung des Proteins.


1 Gelfiltrationschromatographie

Die Gelfiltrationschromatographie ist eine effiziente Methode zur Proteintrennung und -reinigung, bei der Proteinmischungen anhand von Unterschieden in der Molekülgröße getrennt werden.

Wenn die Proteinlösung eine Gelfiltrationschromatographiesäule durchläuft, die gepackte Partikel enthält, ist ihre Fähigkeit, in Partikel einer bestimmten Größe und Porengröße zu diffundieren, ebenfalls unterschiedlich, da verschiedene Proteine unterschiedliche Molekülgrößen haben.

Große Proteine werden zuerst eluiert und das Molekulargewicht ist kleiner. Je später die Elution, um den Zweck der Proteintrennung und -reinigung zu erreichen. Im Allgemeinen ist der Reinigungseffekt umso besser, je dünner und länger die Gelfiltrationschromatographiesäule ist.


Diese Technologie hat viele Vorteile: Sie ist schonend, die Probe lässt sich nicht leicht denaturieren, sie hat kaum Auswirkungen auf das Protein, sie hat eine gute Wiederholbarkeit, verwendet keine organischen Lösungsmittel und weist eine hohe Wiederfindungsrate auf.

Diese Methode kann zur Proteinreinigung, zum Molekulargewicht und zur Bestimmung des Verteilungsbereichs, zum Pufferersatz, zur Entsalzung usw. verwendet werden.


2 Ionenaustauschchromatographie

Die Ionenaustauschchromatographie ist eine Technik zum Trennen und Reinigen von Proteinen basierend auf Art, Menge und Verteilung der Ladungen auf der Oberfläche des Proteins. Unter bestimmten Bedingungen können punktgeladene Proteine mit der Kationen / Anionen-Austausch-Säule kombiniert werden und weisen eine Bindungsstärke auf. Unterschied.

Die Bindung ist reversibel und wird während der Ionenaustauschchromatographie allmählich in der Reihenfolge schwacher bis starker Bindung eluiert, um die Trennung und Reinigung des Proteins zu realisieren.

Diese Technologie bietet die Vorteile einer hohen Auflösung, einer hohen Proteinaustauschkapazität, einer flexiblen Anwendung, eines klaren Trennungsprinzips, einer einfachen Bedienung usw.

Es ist für Anwendungen im Labor- und Industriemaßstab geeignet, während die Gelfiltration schwierig ist, Anwendungen im Industriemaßstab zu erreichen.


3 Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie nutzt die spezifische reversible Adsorption von biologischen Makromolekülen und Liganden, um Proteine zu trennen und zu reinigen. Dieses Verfahren hat die Vorteile einer hohen Spezifität, milder Bedingungen, hoher Geschwindigkeit, hoher Effizienz usw. und eignet sich zur Reinigung von Zielproteinen aus komplexen Proben und Proben mit hohem Verunreinigungsgehalt.

Die spezifische Adsorption des Zielproteins und des Liganden kann verwendet werden, oder die spezifische Bindung zwischen der Markierung und dem Liganden kann verwendet werden, um eine Proteintrennung und -reinigung durch Hinzufügen eines Tags zu erreichen.


4 Tag Reinigung

Die Tag-Reinigung verwendet die genetische Rekombinationstechnologie, um dem Amino- oder Carboxylende des Proteins einige zusätzliche Aminosäuren als Tag hinzuzufügen, was die Trennung und Reinigung erleichtert. Übliche Tags sind GST, His, MBP, Strep-Tag ™ II usw.

GST-Tag: Fügen Sie der Proteinsequenz Glutathion-S-Transferase (GST) hinzu, verwenden Sie dann Glutathion-Sepharose 4B zur Affinitätsreinigung und schneiden Sie es mit Thrombin oder Faktor Xa. Das Verfahren hat milde Bedingungen und kann die Antigenität und Funktion des Zielproteins beibehalten.

Sein Tag: Histidin (His) ist eines der häufigsten Tags, da Histidin sehr klein ist und die Funktion, Aktivität und Struktur des Zielproteins kaum beeinflusst. Fügen Sie der Aminosäure 6-10 Histidine hinzu.

Unter denaturierenden Bedingungen wird es mit Imidazol eluiert, um eine Proteintrennung und -reinigung zu erreichen, da es fest an die Ni2 + -Chelatisierungssäule binden kann.


5 Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie

Das Prinzip der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie lautet: Bei hoher Ionenstärke wird das Protein im Salzwassersystem teilweise desolvatisiert und die internen hydrophoben Gruppen freigelegt.

Diese Reste können reversible hydrophobe Wechselwirkungen mit den hydrophoben funktionellen Gruppen im Medium aufweisen. Wenn die Ionenkonzentration verringert wird, versteckt sich die hydrophobe Gruppe des Proteins, der Effekt verschwindet und die Elution ist abgeschlossen.

Aufgrund der unterschiedlichen hydrophoben Kräfte zwischen verschiedenen Proteinen und den hydrophoben Liganden im Medium kann die Trennung und Reinigung von Proteinen erreicht werden. Das Verfahren ist kostengünstig, kann die biologische Aktivität des Proteins beibehalten und ist weit verbreitet.


6 Elektrophorese

Das Prinzip der Elektrophorese zur Trennung und Reinigung von Proteinen besteht darin, dass sich die gepunkteten kolloidalen Partikel unter Einwirkung eines elektrischen Feldes mit entgegengesetzten elektrischen Eigenschaften zur Elektrode bewegen. Je größer das Molekül ist, desto langsamer ist die Bewegungsgeschwindigkeit.

SDS-PAGE kann zur Trennung und Reinigung von Proteinen verwendet werden. Das Protein kann durch Färbemittel entwickelt werden. Der Vorteil ist, dass es einfach zu bedienen, wirtschaftlich und intuitiv ist. Der Nachteil ist, dass es nicht in großem Maßstab verwendet werden kann.