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Vorteile der Expression und Reinigung von His-Tag-Proteinen

Updatezeit : 2020-11-06

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Vorteile der Expression und Reinigung von His-Tag-Proteinen
Sein Tag basiert auf der Seitenkette von Histidinresten auf der Proteinoberfläche. Unter neutralen und schwach alkalischen Bedingungen kann es mit immobilisierten Metallionen (wie Ni-Ionen, Zn-Ionen, Co-Ionen usw.) interagieren, um gereinigtes Protein zu erhalten. Es ist derzeit eines der gängigen Proteinreinigungs-Tags .

1. Was ist His-Tag?

His-Tag ist das am häufigsten verwendete Tag für die Expression und Reinigung von rekombinantem Protein. Unabhängig davon, ob das exprimierte Protein löslich oder ein Einschlusskörper ist, kann es durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) gereinigt werden.

Die Metallchelat-Affinitätschromatographie, auch als immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) bekannt, ist eine neuartige Trenntechnologie, die in den letzten 30 Jahren entwickelt wurde.

Es wurde zuerst von Paroth et al. Diese Methode verwendet das Prinzip, dass einige Aminosäuren auf der Proteinoberfläche, wie Histidin, Tryptophan und Cystein, mit Metallionen interagieren können, um das Protein abzutrennen.

Diese Funktionen umfassen Koordinatenbindung, elektrostatische Adsorption und kovalente Bindung. Unter diesen ist die Koordinatenbindung die wichtigste. Unter diesen ist der 6-Histidin-Tag (His-Tag) am weitesten verbreitet.


Das His-Tag-Reinigungs-Tag in Kombination mit der Metallchelat-Affinitätschromatographie bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die Trennung, Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen.

Da die Metallchelat-Affinitätschromatographie die Eigenschaften eines einfachen Liganden, einer großen Adsorptionskapazität, milder Trennbedingungen und einer starken Vielseitigkeit aufweist, können die Probenbeladungsbedingungen unter den Bedingungen eines hohen Salzgehalts, einer bestimmten Konzentration an Denaturierungsmittel und Detergens in einem weiten Bereich ausgewählt werden Unter der Haube können Proteine mit 6His-Reinigungsmarkierungen spezifisch mit Affinitätsfüllern kombiniert werden, was allmählich zu einer der effektivsten Techniken zum Trennen und Reinigen von Proteinen und anderen Bioengineering-Produkten wird.


2. His-Tag ist die erste Wahl für die Proteinreinigung


(1) His-Tag ist sehr klein und hat keinen Einfluss auf die Proteinstruktur, nachdem das Fusionsprotein kristallisiert wurde;

(2) Das His-Tag am N-Terminus ist mit dem Transkriptions- und Translationsmechanismus von Bakterien kompatibel, der der Proteinexpression und -reinigung förderlich ist.

(3) Die Verwendung von IMAC (immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie) zur Reinigung des His-Tag-Fusionsproteins ist einfacher;

(4) His-Tag hat fast keinen Einfluss auf die Eigenschaften des Zielproteins selbst und bildet keine Dimere;

(5) Die Immunogenität von His-Tag ist relativ gering und das gereinigte Protein kann Tieren direkt zur Immunisierung und Antikörperherstellung injiziert werden;

(6) Konstruieren Sie ein duales Affinitäts-Tag mit anderen Affinitäts-Tags und können Sie es auf eine Vielzahl von Expressionssystemen anwenden.

3. Häufige Probleme bei der Reinigung von His-Tag-Proteinen


(1) Sein Tag-Protein bindet nicht an das Medium

  • Mögliche Ursache: unangemessene Ultraschallleistung (zu groß, das Protein ist karbonisiert, zu klein, das Protein wird nicht vollständig freigesetzt). Lösung: Ändern Sie die Ultraschallleistung oder andere Methoden, um die Zellen zu zerbrechen.
  • Die Probe oder der Puffer ist ungeeignet. Lösung: Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von Chelatbildner, Reduktionsmittel und Imidazol im Puffer nicht sehr hoch ist.
  • Das His-Tag ist nicht vollständig belichtet. Lösung: Denaturierungsmittel (4-8 M Harnstoff, 4-6 M Guanidinhydrochlorid) zum Puffer geben und dann mit IMAC-Medium reinigen.
  • Das His-Tag ist verloren. Lösung: Erhöhen Sie gegebenenfalls die Anzahl von His und stellen Sie die korrekte Expression sicher, während Sie die Ladegeschwindigkeit verringern, um eine ausreichende Inkubationszeit sicherzustellen.

(2) Es ist schwierig, sein Tag-Protein auf dem Medium zu eluieren

  • Mögliche Ursache: Die Elutionsbedingungen sind zu mild. Lösung: Erhöhen Sie die Konzentration an eluiertem Imidazol oder senken Sie den pH-Wert.
  • Mögliche Ursache: Das Protein lagert sich auf dem Medium ab. Lösung: Reduzieren Sie die Probenbelastung und optimieren Sie die Chromatographiebedingungen.
  • Mögliche Ursache: unspezifische Bindung. Lösung: 2% Triton X-100 und NaCl zum Puffer geben.

(3) Der Elutionspeak weist viele Verunreinigungen auf

Mögliche Gründe: unspezifische Bindung, unvollständige Reinigung, Abbau usw. Lösung: Fügen Sie während des Reinigungsprozesses Proteininhibitoren hinzu, um den Abbau zu verhindern, waschen Sie sie nach dem Laden gründlich und fügen Sie eine bestimmte Menge NaCl und Imidazol hinzu, um die unspezifische Bindung zu verringern.

(4) Nach mehrmaliger Verwendung sind die Medienbindungseffizienz und die Säuleneffizienz verringert

Mögliche Ursache: Auf dem Medium lagern sich große Mengen an Verunreinigungen ab. Lösung: gründliche Reinigung, IDA / IMAC-De-Nickel-Regenerationsbehandlung.



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