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8 Bedingungen für die Expression von Protein durch Mikroorganismen

Updatezeit : 2020-09-27

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8 Bedingungen für die Expression von Protein durch Mikroorganismen

Die Proteinexpression in Mikroorganismen ist eine Kerntechnologie in der Biotechnologie. Es ist relativ einfach, das Protein in einem Wirt zu exprimieren, der der Quelle des Zielproteins ähnlich ist.

Meistens müssen wir jedoch Protein in einem Wirt exprimieren, der sich von der Proteinquelle unterscheidet, beispielsweise in ekaryotischen Proteinen in prokaryotischen Zellen, was normalerweise eine Herausforderung darstellt.


Hier teiltGeneral Biosystems Ihnen verschiedene Tools mit, mit denen Sie die Proteinexpression systemübergreifend erreichen können.

1. Codon-Optimierung
Die Codonoptimierung besteht darin, Codons einzuführen, die das Wirtssystem eher in den von uns konstruierten Vektor einlesen möchte, damit sie leichter in Aminosäuren übersetzt werden können, was die Translationsgeschwindigkeit erhöht und die Effizienz der Proteinexpression erhöht.

2. Reinigungs-Tags

Wenn wir Proteine in Mikroorganismen exprimieren, reinigen wir normalerweise die Proteine. Wenn Sie nur Ganzzellextrakte oder lysierte Extrakte verwenden, müssen Sie natürlich keine Proteinreinigung in Betracht ziehen.

Um eine Proteinreinigung zu erreichen, müssen wir dem Protein Reinigungsmarkierungen hinzufügen. Gegenwärtig wurden viele Reinigungsmarken systematisch untersucht und in der Praxis angewendet. Zu den häufig verwendeten Reinigungs-Tags gehören His-Tag, Strep-II-Tag, GST, Flat-Tag usw.


3. Molekulare Chaperone und Faltungsenzyme
Um ein nützliches Protein zu erhalten, ist es sehr wichtig sicherzustellen, dass das Protein korrekt gefaltet ist. Um dem Protein zu helfen, sich richtig zu falten und die Bildung unlöslicher Einschlusskörper zu verhindern, benötigen wir Helfervektoren, die Chaperone und Faltungsenzyme exprimieren.

4. Protein-Expressionsort

Vor dem Experiment müssen wir prüfen, wo das Protein exprimiert wird, ob es im Zytoplasma, in der interzellulären Substanz oder in der extrazellulären Substanz sekretiert wird.

Wenn ein Protein Disulfidbindungen enthält, sollten wir es besser in der oxidativen Umgebung der interzellulären Substanz exprimieren.

Die oxidierende Umgebung kann Proteinen helfen, die richtigen Disulfidbindungen zu bilden, um die richtige Struktur zu erhalten.

Wenn Sie möchten, dass das Protein an einer bestimmten Stelle in der Zelle exprimiert oder außerhalb der Zelle sekretiert wird, müssen Sie dem N-Terminus des Proteins ein Signalpeptid hinzufügen. Mit Hilfe von Signalpeptiden können Proteine an bestimmte Stellen übertragen werden.


5. Proteinexpressionsweg

Die Proteinsekretion und -expression hat viele Vorteile. Einerseits kann die Sekretion und Expression von Proteinen die Toxizität und die metabolische Belastung der Wirtsbakterien verringern und die Anpassungsfähigkeit der Bakterien erhöhen. Andererseits ist der Proteingehalt der Wirtsbakterien im periplasmatischen Raum und im extrazellulären Medium sehr gering, was der Reinigung des Zielproteins förderlich ist.

Verschiedene Expressionswege haben einen großen Einfluss auf die Faltungseffizienz von Proteinen.


6. Expressionsstamm

Verschiedene Escherichia coli-Stämme weisen große Unterschiede in den Kulturbedingungen und den Fähigkeiten zur Expression fremder Gene auf. Daher spielt die Auswahl verschiedener Wirtsbakterien eine entscheidende Rolle bei der Akkumulation von Expressionsprodukten und der nachgeschalteten Trennung und Reinigung.

Die Verwendung von Mutantenstämmen, die in der Proteaseexpression defekt sind, kann die Sekretion und Expression von rekombinanten Proteinen erhöhen.

Einige defekte Stämme (wie Genmutanten, die äußere Membranelemente synthetisieren) können lösliche aktive Proteine mit korrekter räumlicher Struktur und Disulfidbindungen produzieren. Sie können die behindernde Wirkung der Zellwand beim Transmembrantransport von Fremdproteinen vermeiden und die Sekretion von erleichtern rekombinante Proteine in das Kulturmedium.


7. Faktoren wie Kulturmedium, Temperatur, Induktionsbedingungen usw.

Die Zusammensetzung des Mediums, die Kulturmethode, die Kulturbedingungen und die Akkumulation inhibitorischer Metaboliten während des Kulturprozesses beeinflussen die Expression und Sekretion von rekombinantem Protein in manipulierten Bakterien. Unter diesen sind die Nährstoffzusammensetzung des Mediums, der pH-Wert und die Temperatur wichtige Faktoren, die das Wachstum und die Expression von Fremdproteinen manipulierter Bakterien beeinflussen und die Aktivität, Sekretion und Expression von Protease beeinflussen können.

Die Zugabe von Glycin zum Kulturmedium kann die Sekretion von Protein aus dem periplasmatischen Raum in das Extrazellular fördern, ohne eine Autolyse der Bakterien zu verursachen, und verursacht keine signifikante Bakterienlyse. Die Zugabe von Zuckergummi und TritonX-100 zum Medium kann die Bildung von Einschlusskörpern in der peripheren Höhle verhindern und die Effizienz der extrazellulären Expression verbessern.

Das Ändern des osmotischen Drucks des Mediums, die kurzfristige Thermoschockinduktion und das Verringern der Temperatur während der Induktion erhöhen die lösliche Expression von rekombinantem Protein in E. coli signifikant.

Zusätzlich müssen für Stämme, die eine IPTG-Induktion erfordern, die Induktionszeit, die Temperatur und die Kulturzeit optimiert werden.


8. Zellkulturzeit

Eine angemessene Zellkulturzeit ist ein wichtiger Faktor, der die Zellintegrität und das Proteinexpressionsniveau bestimmt. Eine lange Zellkulturzeit führt zur Zelllyse, zum Verlust des Zielproteins und zur Freisetzung toxischer Proteasen.

Die direkte Folge einer zu kurzen Zellkulturzeit ist, dass die Zellkonzentration nicht ausreicht und die Zielproteinausbeute zu niedrig ist. Daher muss die Kultivierungszeit von rekombinanten Stämmen optimiert werden.